二氧化氮誘導(dǎo)大鼠哮喘易感性變化的分子機(jī)制研究.pdf

1、近年來(lái),隨著工業(yè)化持續(xù)快速推進(jìn)、城市機(jī)動(dòng)車數(shù)量迅猛增加,城市化進(jìn)程不斷加快,以及煤炭、石油等能源利用迅猛增長(zhǎng),我國(guó)大氣污染日益嚴(yán)重,給居民健康造成了嚴(yán)重的威脅。目前我國(guó)大氣污染呈現(xiàn)出煤煙型與機(jī)動(dòng)車污染共存的新型復(fù)合污染,霾和光化學(xué)煙霧頻繁及NO2濃度居高不下的狀況。NO2作為大氣污染物主要成分之一,逐漸引起了世界各國(guó)的普遍關(guān)注。監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示,城市室外NO2濃度一般不超過(guò)0.5ppm,在交通擁堵的高峰期,可高達(dá)到4ppm。室內(nèi)NO2污染也

2、不容忽視,其濃度也可高達(dá)2ppm。文獻(xiàn)提示,呼吸系統(tǒng)是NO2的主要毒性作用靶器官,NO2吸入后可進(jìn)入下呼吸道直至肺的深部,主要引起深部呼吸道、細(xì)支氣管及肺泡損傷。因此,NO2污染與呼吸系統(tǒng)損傷和疾病的相關(guān)性引起了人們的重視。
　　支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘),是由多種炎癥細(xì)胞、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子共同參與的一種慢性氣道炎癥,表現(xiàn)為Th1和Th2細(xì)胞失衡及Th2細(xì)胞優(yōu)勢(shì)應(yīng)答。目前全世界支氣管哮喘患者約3億人,我國(guó)的哮喘發(fā)病率為1％,兒童高達(dá)

3、3%。近年來(lái),越來(lái)越多的流行病學(xué)研究表明,NO2污染與居民哮喘發(fā)病率和死亡率的增高相關(guān),特別是會(huì)使兒童哮喘發(fā)病率增加。到目前為止,NO2與哮喘的相關(guān)性研究主要集中在流行病學(xué)領(lǐng)域,且研究結(jié)果不一致,尚缺乏直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。此外,關(guān)于NO2誘導(dǎo)哮喘易感性變化的分子機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。由此提出本課題,研究NO2暴露對(duì)肺的炎癥損傷效應(yīng)及其與哮喘的相關(guān)性,在此基礎(chǔ)上探討NO2誘導(dǎo)哮喘易感性增加的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制及其可能的分子信號(hào)通路。
　　

4、1.本課題通過(guò)對(duì)成年正常大鼠進(jìn)行動(dòng)式NO2急性熏氣染毒,每天5h,連續(xù)7d,染毒劑量為5mg/m3,研究急性NO2吸入暴露誘導(dǎo)成年大鼠肺炎癥損傷效應(yīng)及哮喘相關(guān)基因的變化。采用酶聯(lián)免疫技術(shù)測(cè)定肺組織Th2細(xì)胞因子IL-4含量,采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)測(cè)定肺組織IFN-γ、Muc5ac、T-bet和GATA3 mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示,急性NO2吸入暴露即可誘導(dǎo)大鼠肺組織IL-4含量增加,引起肺組織Muc5ac和GATA3 mRNA的表

5、達(dá)升高及T-bet和IFN-γmRNA的表達(dá)降低。這一結(jié)果表明急性NO2吸入暴露造成T-bet/GATA3表達(dá)失衡,進(jìn)而引起Th1/Th2失衡,這可能是NO2暴露引起大鼠氣道炎癥及氣道黏液高分泌的重要機(jī)制之一,同時(shí)也可能是NO2污染地區(qū)哮喘發(fā)病率逐年上升的一個(gè)重要原因。
　　2.在日常生活中,人們對(duì)NO2的接觸往往是慢性的、低劑量的。而且哮喘本身也是一種慢性氣道炎癥反應(yīng)。然而,在慢性的、低劑量的接觸情況下NO2是否通過(guò)調(diào)控T-be

6、t/GATA3的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控哮喘Th1/Th2失衡,最終導(dǎo)致氣道炎癥及氣道黏液高分泌等哮喘樣癥狀尚不清楚,其發(fā)生的分子機(jī)制更是鮮見(jiàn)報(bào)道。因此,在上一部分研究的基礎(chǔ)上,采用不同濃度NO2(2和5mg/m3)對(duì)成年正常大鼠進(jìn)行慢性吸入染毒,每天5h,連續(xù)28d,考察大鼠肺組織病理特征、超微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子及JAK/STAT6信號(hào)通路上關(guān)鍵因子的變化,深入探討NO2對(duì)大鼠肺慢性炎癥損傷和Th1/Th2細(xì)胞失衡及其可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。組

7、織病理?yè)p傷采用常規(guī)HE染色技術(shù),超微結(jié)構(gòu)改變采用電鏡技術(shù),肺組織Th2細(xì)胞因子IL-4含量測(cè)定采用酶聯(lián)免疫技術(shù)測(cè)定,肺組織IL-1β、ICAM-1、Muc5ac、GATA3、T-bet、IFN-γ、IL-4α、JAKs、STAT6mRNA表達(dá)采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)測(cè)定,p-ERK1/2、p-Lck、p-NF-κB、p-STAT6蛋白表達(dá)采用Western blot技術(shù)測(cè)定。結(jié)果顯示,慢性吸入NO2可引起肺組織病理學(xué)損傷和超微結(jié)構(gòu)改

8、變,表現(xiàn)為氣道上皮細(xì)胞破壞,支氣管壁增厚,管壁周圍可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),氣管褶皺變厚,氣道內(nèi)可見(jiàn)黏液分泌;電鏡結(jié)果顯示NO2暴露組大鼠肺泡Ⅱ型細(xì)胞結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出一定程度的變性,纖毛有所脫落,膠原纖維沉積現(xiàn)象嚴(yán)重。此外,與第二章急性暴露結(jié)果相一致,慢性吸入NO2同樣可以引起大鼠肺組織轉(zhuǎn)錄因子GATA3表達(dá)上調(diào),T-bet表達(dá)下調(diào),Th2細(xì)胞因子IL-4的分泌增加,Th1細(xì)胞因子IFN-γ表達(dá)減少,同時(shí)炎性因子IL-1β、黏附分子ICAM-1和

9、黏蛋白基因Muc5ac mRNA表達(dá)量也增加,并呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系,即使在低濃度暴露組(2 mg/m3)也表現(xiàn)出損傷效應(yīng);此外,JAK/STAT6信號(hào)傳導(dǎo)通路中IL-4Rα、JAK1和STAT6表達(dá)增加,STAT6、NF-κB、ERK1/2和Lck蛋白的磷酸化水平顯著上升,且呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。以上結(jié)果表明,慢性NO2吸入暴露可引起正常大鼠肺組織相關(guān)基因出現(xiàn)與哮喘患者類似的改變,如Th2細(xì)胞因子、黏蛋白基因、粘附因子發(fā)生濃度

10、依賴性上調(diào),Th1細(xì)胞因子下調(diào),在此過(guò)程中激活了大鼠肺組織JAK/STAT6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及調(diào)控因子NF-κB、ERK1/2和Lck蛋白,進(jìn)而調(diào)控Th1/Th2細(xì)胞因子的分泌,導(dǎo)致機(jī)體Th1/Th2失衡及呈現(xiàn)Th2優(yōu)勢(shì)應(yīng)答。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)NO2慢性吸入暴露模型進(jìn)一步證明NO2暴露可以引起機(jī)體Th1/Th2失衡及Th2優(yōu)勢(shì)應(yīng)答,并且JAK/STAT6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及調(diào)控因子NF-κB、ERK1/2和Lck參與了調(diào)控。由此提示NO2暴露人群可能較正

11、常人更易患哮喘,以上途徑可能是NO2暴露引起氣道炎癥反應(yīng)的重要機(jī)制之一。
　　3.為了進(jìn)一步探討NO2誘導(dǎo)哮喘易感性增加的可能分子機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立成年大鼠哮喘模型,觀察NO2對(duì)哮喘大鼠肺組織病理特征、超微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子及JAK/STAT6信號(hào)通路上關(guān)鍵因子的影響。動(dòng)物染毒處理:實(shí)驗(yàn)用Wistar雄性大鼠(鼠齡為42d)隨機(jī)分為3組,分別為對(duì)照組、OVA組和NO2+OVA組。首先,NO2+OVA組大鼠暴露于濃度為5mg

12、/m3的NO2,每天5 h,對(duì)照組和OVA組暴露于過(guò)濾的新鮮空氣中5h,連續(xù)42d;其次,OVA組和NO2+OVA組在熏氣第22d、29d分別腹腔注射10%OVA和10%氫氧化鋁混合液1mL致敏,第36d開(kāi)始連續(xù)7d1%OVA超聲波霧化激發(fā)(20min/d)。采用常規(guī)HE染色和電鏡技術(shù)分別考察肺組織病理學(xué)和超微結(jié)構(gòu)改變,采用酶聯(lián)免疫技術(shù)測(cè)定肺組織IL-4和血清OVA特異性IgE含量,采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)測(cè)定IL-1β、ICAM-

13、1、Muc5ac、GATA3、T-bet、IFN-γ、IL-4α、JAKs、STAT6 mRNA表達(dá),采用Western blot技術(shù)測(cè)定p-ERK1/2、p-Lck、p-NF-κB、p-STAT6蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示,NO2吸入暴露加重哮喘大鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、氣道黏液分泌等病理學(xué)改變及膠原纖維增生、纖毛脫落等超微結(jié)構(gòu)改變;NO2吸入暴露促進(jìn)哮喘大鼠IL-4、IL-1β、ICAM-1、Muc5ac、GATA3表達(dá)及血清OVA特異性Ig

14、E含量持續(xù)增加,而IFN-γ、T-bet表達(dá)進(jìn)一步減少;NO2暴露促進(jìn)哮喘大鼠肺組織JAK/STAT6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及調(diào)控因子NF-κB、ERK1/2和Lck蛋白的激活水平。以上結(jié)果表明,NO2暴露增加成年大鼠哮喘易感性,其可能通過(guò)促進(jìn)T-bet/GATA3比例失調(diào),加重Th1/Th2偏移,進(jìn)而調(diào)控Th1/Th2細(xì)胞因子的分泌,同時(shí)誘導(dǎo)JAK/STAT6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及調(diào)控因子NF-κB、ERK1/2和Lck激活水平上升,從而加重哮喘的炎癥

15、反應(yīng)和過(guò)敏性反應(yīng),這可能是暴露于NO2的人群更敏感、更易患哮喘,其發(fā)生哮喘時(shí)的反應(yīng)更嚴(yán)重的重要機(jī)制之一,同時(shí)也證實(shí)NO2污染是哮喘發(fā)病率增加的一個(gè)重要誘因。
　　4.流行病學(xué)研究顯示,NO2暴露對(duì)不同年齡的人群所誘導(dǎo)的哮喘癥狀不同,其哮喘發(fā)作程度也不同。兒童發(fā)病率較成年人更高,作者推測(cè)兒童可能較成年人更敏感,更易發(fā)生哮喘或哮喘發(fā)作程度更嚴(yán)重。因此,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立幼年大鼠哮喘模型,驗(yàn)證NO2暴露是否通過(guò)與成年人相同的機(jī)制誘導(dǎo)兒童哮喘

16、易感性增加。實(shí)驗(yàn)用Wistar雄性大鼠(鼠齡為21d)隨機(jī)分為3組,分別為對(duì)照組、OVA組和NO2+OVA組。動(dòng)物染毒處理和實(shí)驗(yàn)方法同第三部分。結(jié)果顯示,通過(guò)比較NO2暴露下幼年和成年哮喘大鼠的上述指標(biāo)后發(fā)現(xiàn),幼年大鼠上述指標(biāo)的變化較成年大鼠更明顯,提示幼年大鼠對(duì)NO2更敏感,損傷效應(yīng)更嚴(yán)重,這一結(jié)果解釋了作者之前的推測(cè),這可能是NO2污染地區(qū)兒童比成年人哮喘發(fā)病率高的一個(gè)重要原因。
　　5.研究發(fā)現(xiàn),哮喘兒童外周血淋巴細(xì)胞DNA

17、斷裂程度增加,可能與哮喘患者機(jī)體ROS過(guò)量積累所導(dǎo)致的氧化損傷有關(guān)。而NO2本身能否引起哺乳動(dòng)物DNA損傷,進(jìn)而影響哮喘疾病的發(fā)生發(fā)展,尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。為此,本研究通過(guò)建立整體動(dòng)物染毒模型,研究了NO2吸入誘導(dǎo)大鼠DNA損傷效應(yīng),旨在探討其誘導(dǎo)哮喘易感性變化的可能原因。結(jié)果顯示,NO2急性和慢性吸入暴露均可導(dǎo)致大鼠肺細(xì)胞DNA斷裂程度增加、DPC系數(shù)上升及骨髓微核發(fā)生率升高,且存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。說(shuō)明NO2吸入暴露可誘導(dǎo)機(jī)體遺傳物