蒙藥特潤(rùn)舒都樂(lè)水母液浸膏及其主要單體通過(guò)TLR4的抗炎信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究.pdf

1、蒙藥特潤(rùn)舒都樂(lè)(TRSDL)是課題組為治療奶牛乳房炎而配置的，經(jīng)多年研究應(yīng)用于治療奶牛乳房炎的抗炎免疫復(fù)方。發(fā)現(xiàn)蒙藥特潤(rùn)舒都的水母液浸膏也具有良好的抗炎和提高機(jī)體免疫力的作用。研究復(fù)方蒙藥特潤(rùn)舒都樂(lè)水母液浸膏及其主要活性成分的抗炎免疫機(jī)制，為蒙藥特潤(rùn)舒都樂(lè)治療奶牛乳腺炎提供理論依據(jù)，實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果如下:
　?、俨捎眉?xì)菌脂多糖LPS誘導(dǎo)小鼠RAW264.7細(xì)胞構(gòu)建炎癥細(xì)胞模型。
　?、诓捎肅CK8法檢測(cè)TRSDL的水母液浸膏及

2、其主要活性成分對(duì)RAW264.7細(xì)胞的增殖作用的影響，結(jié)果:低濃度TRSDL水母液浸膏（1.00、5.00、10.00、25.00 mg/mL）對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞沒(méi)有生長(zhǎng)抑制作用，與不加藥物的空白對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異(p＞0.05)，而高濃度TRSDL水母液浸膏（50.00mg/mL）顯著抑制小鼠RAW264.7細(xì)胞的生長(zhǎng)(p＜0.05); TRSDL水母液浸膏的主要活性成分單體梔子苷20mmol/L、沒(méi)食子酸32μg/L和

3、鹽酸小檗堿40μ mol/L分別單獨(dú)作用48h能夠明顯抑制RAW264.7細(xì)胞的生長(zhǎng)(p＜0.05)。由3種單體組成的復(fù)合物在該濃度時(shí)作用48h也能夠顯著抑制RAW264.7細(xì)胞的生長(zhǎng)(p＜0.05)。
　?、鄄捎脽晒舛縍T-PCR法檢測(cè)TRSDL的水母液浸膏對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的IL-1、IL-6、TNF-α、TLR4及NF-κB mRNA的影響，ELISA的方法檢測(cè)IL-1、IL-6、TNF-α蛋白質(zhì)的表達(dá)，We

4、stern Blotting法檢測(cè)TLR4、NF-κB蛋白質(zhì)的表達(dá)，結(jié)果:TRSDL的水母液浸膏濃度依賴(lài)性地抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子IL-1、IL-6及TNF-α mRNA的含量及其蛋白質(zhì)的表達(dá)(p＜0.05)，10mg/mL和25mg/mLTRSDL水母液浸膏抑制作用與地塞米松的效果相當(dāng)(p＜0.05)。TRSDL的水母液浸膏濃度依賴(lài)性地抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7細(xì)胞TLR4、NF-κB mRNA

5、和蛋白質(zhì)的表達(dá)。
　?、躓ST-8方法檢測(cè)TRSDL水母液浸膏的活性成分及其復(fù)合物對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞增殖率的影響，結(jié)果:單體梔子苷、沒(méi)食子酸、鹽酸小檗堿及3種單體復(fù)合物、NF-κB抑制劑PDTC和地塞米松分別能夠顯著緩解LPS對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞增殖的抑制作用(p＜0.05)。
　　⑤采用ELISA的方法檢測(cè)TRSDL水母液浸膏的主要活性成分對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的炎性因子IL-1、IL-6

6、和TNF-α釋放的影響，結(jié)果:梔子苷、沒(méi)食子酸、鹽酸小檗堿及3種單體復(fù)合物能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7細(xì)胞的IL-1、IL-6及TNF-α表達(dá)，與蒙藥特潤(rùn)舒都樂(lè)水母液浸膏結(jié)果均一致。
　?、捱M(jìn)一步運(yùn)用Western Blotting法和EMSA法檢測(cè)TRSDL水母液浸膏的主要活性成分的單體及復(fù)合物對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞p-IκBα、p-p65、p65及TLR4的蛋白表達(dá)和P65與啟動(dòng)子結(jié)合活性的影響。結(jié)

7、果:TRSDL單體梔子苷、沒(méi)食子酸、鹽酸小檗堿及3種單體組成的復(fù)合物、NF-κB抑制劑PDTC和地塞米松不影響總p65蛋白質(zhì)水平，但分別能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7細(xì)胞的磷酸化IκBα和p65蛋白質(zhì)表達(dá)(p-IκBα和p-p65)(p＜0.05)。各用藥組顯著抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7細(xì)胞TLR4 mRNA含量和蛋白質(zhì)表達(dá)，與蒙藥特潤(rùn)舒都樂(lè)水母液浸膏結(jié)果一致。單體梔子苷、沒(méi)食子酸、鹽酸小檗堿、3種單體復(fù)合物、N

8、F-κB抑制劑PDTC和地塞米松分別能夠顯著減少LPS誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7細(xì)胞p65與啟動(dòng)子結(jié)合的活性(p＜0.05)。
　　綜上所述，實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了細(xì)菌脂多糖LPS誘導(dǎo)小鼠RAW264.7細(xì)胞炎癥細(xì)胞模型;確定了蒙藥特潤(rùn)舒都樂(lè)水母液浸膏及其主要活性成分的用藥量:對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞的作用濃度可選為水母液浸膏低于（50.00mg/mL），而TRSDL水母液浸膏的主要活性成分單體梔子苷、沒(méi)食子酸和鹽酸小檗堿分別選用文獻(xiàn)中

9、常用的20mmol/L、32μg/L、40μmol/L;蒙藥特潤(rùn)舒都樂(lè)水母液浸膏能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的TNF-α、IL-1和IL-6 mRNA含量及其蛋白質(zhì)的表達(dá)，同時(shí)在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平顯著抑制其TLR4和NF-κB含量，提示蒙藥特潤(rùn)舒都樂(lè)水母液浸膏可通過(guò)TLR4-NF-κB通路發(fā)揮抗炎免疫作用。蒙藥特潤(rùn)舒都樂(lè)的3種單體及其復(fù)合物能在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平顯著下調(diào)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的IL-1、IL-6和