團(tuán)頭魴甘露糖受體CTLD4-8結(jié)構(gòu)域抗體制備及功能分析.pdf

1、甘露糖受體(MR, CD206)是甘露糖受體家族中最先發(fā)現(xiàn)的成員，它能夠識別多種內(nèi)源性和外源性甘露糖化配體，在宿主免疫和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。MR胞外有8個(gè)C-型凝集素樣結(jié)構(gòu)域(CTLDs)，CTLD4-8結(jié)構(gòu)域有同等于完整的MR結(jié)合天然糖蛋白配體能力，能介導(dǎo)巨噬細(xì)胞對多種病原微生物的識別和吞噬。MR表達(dá)并不局限于巨噬細(xì)胞，在其他細(xì)胞如腎小球系膜細(xì)胞、淋巴和肝內(nèi)皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、成肌細(xì)胞以及腦中的小膠質(zhì)細(xì)胞等都發(fā)現(xiàn)有MR

2、表達(dá)。相對于哺乳動(dòng)物MR的結(jié)構(gòu)、功能以及分布已有的詳盡研究，有關(guān)魚類MR的報(bào)道卻很少，尤其是MR蛋白的分布，迄今還沒有過報(bào)道。本研究從MR的CTLD4-8結(jié)構(gòu)域表達(dá)載體的構(gòu)建、原核表達(dá)、蛋白純化等方面入手，進(jìn)而制備了抗團(tuán)頭魴MR的多克隆抗體（MaMR-CTLD4-8）。結(jié)合免疫組化技術(shù)系統(tǒng)研究了MR蛋白在團(tuán)頭魴胚胎期以及幼魚期各組織的分布，并研究了MR與GFP-E.coli的相互作用，探討其在團(tuán)頭魴巨噬細(xì)胞吞噬病原微生物過程中發(fā)揮的作用

3、，以及引起的免疫應(yīng)答。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)在優(yōu)化條件下，高效表達(dá)CTLD4-8重組蛋白。經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot鑒定，證明成功表達(dá)了分子量大小為110kDa的融合蛋白;
　　(2)純化目的蛋白免疫日本大耳白兔三次，制備了多克隆抗體。ELISA檢測抗血清效價(jià)在51，200左右。以提取的團(tuán)頭魴組織總蛋白作為蛋白樣品，經(jīng)Western-blot分析，在PVDF膜上檢測出單一條帶，分子量在170～180

4、kDa，與預(yù)測的MR大小相符。說明制備的多克隆抗體具有特異性，可用于下面的研究;
　　(3)利用免疫組化技術(shù)研究了MR蛋白在團(tuán)頭魴胚胎期及幼魚各組織中的分布。結(jié)果表明MR首先出現(xiàn)在受精卵期的卵黃囊處，在出膜期分布廣泛。MR蛋白分布與早期巨噬細(xì)胞時(shí)空分布有一定關(guān)聯(lián)性，預(yù)測早期巨噬細(xì)胞就開始表達(dá)MR，而不是局限于終端分化巨噬細(xì)胞。MR廣泛表達(dá)于團(tuán)頭魴頭腎、體腎、肝、腦、腸、鰓、肌肉和心臟等組織，而在脾中的表達(dá)很少，但是嗜水氣單胞菌感染