里氏木霉種間原生質(zhì)體融合增強(qiáng)羧甲基纖維素酶的活性[外文翻譯]

1、<p>　　本科畢業(yè)論文外文翻譯</p><p><b>　　譯文：</b></p><p>　　里氏木霉種間原生質(zhì)體融合增強(qiáng)羧甲基纖維素酶的活性</p><p>　　ENZYME AND MICROBIAL TECHNOLOGY 38 (2006) 719–723</p><p>　　V.R. Prabava

2、thy,N. Mathivanan *, E. Sagadevan, K. Murugesan, D. Lalithakumari</p><p>　　摘要：原生質(zhì)體分離里氏木霉菌株用0.6M氯化鉀作為滲透壓穩(wěn)定劑裂解酶（西格瑪化工有限公司，美國(guó)）PTr2內(nèi)原生質(zhì)體融合菌株進(jìn)行了使用與STC（山梨醇,緩沖液,氯化鈣）緩沖區(qū)40％聚乙二醇。瑞氏木霉的原生質(zhì)體的融合已對(duì)再生羧甲基纖維素瓊脂（纖維素酶）選擇性培養(yǎng)基，1

3、5融合子，作進(jìn)一步的研究選擇大多數(shù)展出的融合子在馬鈴薯培養(yǎng)基上，非融合子比親代菌株菌絲生長(zhǎng)速度快和豐富的孢子。</p><p>　　清理周圍的區(qū)域，在種植時(shí)，纖維素酶融合子后代菌絲生長(zhǎng)出現(xiàn)表明了羧甲基纖維素外高層次比非融合子（纖維素酶）的分泌CMC酶的活性高，估計(jì)有80%的融合子，比增加了兩倍米酶有兩個(gè)融合子，SFTr2和SFTr3相比,家長(zhǎng)更緊張PTr2記錄活動(dòng)。本研究結(jié)果顯示的范圍和原生質(zhì)體融合技術(shù)，可以用來(lái)

4、發(fā)展缺乏內(nèi)在的絲狀菌有性繁殖優(yōu)良雜交菌株的意義。</p><p>　　關(guān)鍵詞：里氏木霉；原生質(zhì)體；融合；再生；羧甲基纖維素</p><p><b>　　1 簡(jiǎn)介</b></p><p>　　里氏木霉纖維素酶是一種已知的纖維素酶生產(chǎn)[1]被廣泛用于降解纖維素材料和纖維素材料工藝,特別是在紡織和造紙工業(yè)此外，還用于廢水處理的應(yīng)用[2]。真菌原生質(zhì)體

5、是一個(gè)在生理和遺傳研究的重要工具[3,4]和基因操作能夠成功地通過(guò)在缺乏有性繁殖能力的絲狀真菌原生質(zhì)體融合的實(shí)現(xiàn)[5]。因此，原生質(zhì)體融合是在菌種改良計(jì)劃的重要途徑之一[6]。分離,原生質(zhì)體融合和再生方面已取得木霉屬為主，以提高其生物防治潛力[7,8]。然而，有限的嘗試了改進(jìn),以提高木霉菌株產(chǎn)酶[1,9]。因此，目前正在利用這一木霉菌株提高酶的生產(chǎn)工藝的改進(jìn)余地很大。在這種背景下，目前的工作目的為里氏木霉菌株的原生質(zhì)體，開(kāi)展的調(diào)查在細(xì)胞

6、外羧甲基纖維素酶（纖維素酶）的融合株后代的生產(chǎn)目標(biāo),內(nèi)原生質(zhì)體融合株。</p><p><b>　　2 材料和方法</b></p><p>　　2.1 里氏木霉的培養(yǎng)</p><p>　　甲木霉菌菌株分離出了一大批來(lái)自不同的土壤和分解有機(jī)物的特點(diǎn)記錄并在我們的實(shí)驗(yàn)室維護(hù)。定性和定量篩選外溶解酶，導(dǎo)致在選擇瑞氏木霉菌株P(guān)Tr2，一個(gè)纖維素酶生產(chǎn)，

7、并用于培養(yǎng)原生質(zhì)體融合方案。瑞氏木霉培養(yǎng)維持在含有馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）的試管或錐形瓶里在室溫（28土2oC）。</p><p>　　2.2 原生質(zhì)體分離瑞氏木霉</p><p>　　對(duì)瑞氏木霉（PTr2）接種是在一個(gè)錐形燒瓶中加入5毫升無(wú)菌水并輕輕搖晃5分鐘培養(yǎng)5天.關(guān)于接種1毫升（lx10/毫升孢子），從這個(gè)孢子懸液轉(zhuǎn)移到100毫升馬鈴薯葡萄培養(yǎng)基并在轉(zhuǎn)速100的室溫下?lián)u床搖16

8、個(gè)小時(shí)。培養(yǎng)好的新一代菌絲用濾紙過(guò)濾。提取100毫克的新鮮菌絲體用無(wú)菌蒸餾水洗滌，接著用0.1 MPH為6.0的磷酸緩沖液沖洗并放到含磷酸濃度為8毫克每毫升滲透壓為0.6的氯化鉀緩沖液中.菌絲的混合物培養(yǎng)在具有75轉(zhuǎn)的速度在室溫下振動(dòng)篩。在菌絲體和原生質(zhì)體溶解間隔30分鐘后放到光學(xué)顯微鏡下觀察。經(jīng)過(guò)3小時(shí)，酶的原生質(zhì)體混合物用消毒棉花消毒的100轉(zhuǎn)秒的離心機(jī)中離心10分鐘。提取原生質(zhì)體的上清液去掉沉淀物緩沖液滲透壓穩(wěn)定劑的解決方案。&l

9、t;/p><p>　　2.3 原生質(zhì)體融合</p><p>　　里氏木霉原生質(zhì)體融合由Stasz[ll]等人提出來(lái)的。用聚乙二醇（PEG）（3500兆瓦，美國(guó)西格瑪化工有限公司）（0.6M山梨醇；的1O mM的Tris -鹽酸：10mM氯化鈣，pH值6.5）來(lái)配置緩沖液。一毫升原生質(zhì)體懸浮液（約1×106原生質(zhì)體/毫升）與等體積的80％PEG溶液融合混合物在室溫下培養(yǎng)10分鐘后。稀釋

10、的混合物與STC的緩沖1mL。</p><p>　　2.4 融合再生和非原生質(zhì)體融合</p><p>　　用聚乙二醇沖洗混合物融兩次，使用STC緩沖液使用瑞氏木霉原生質(zhì)體融合離心10分鐘100轉(zhuǎn)收集。這些融合原生質(zhì)體懸浮在100微升STC的緩沖液和2％纖維素酶選擇性培養(yǎng)基。接種在含有纖維素酶的馬鈴薯培養(yǎng)基的平板上使再生菌落分離和傳代。將融合原生質(zhì)體滴上0.6M氯化鉀液滲透壓穩(wěn)定劑放在顯微鏡

11、上觀察并拍照。瑞氏木霉的非融合原生質(zhì)體作為對(duì)照組。</p><p>　　2.5 融合子，非融合子和親本里氏木霉在纖維素酶的選擇培養(yǎng)基生長(zhǎng)狀況</p><p>　　約15融合子（SFTrl - SFTr15）在被選定的里氏木霉根據(jù)其選擇性培養(yǎng)基上快速增長(zhǎng)。兩個(gè)非融合子（NFTrl和NFTr2）被選中來(lái)與融合子的變化相比較。 非融合子和親本。每一個(gè)融合子菌絲斷裂，非融合子和親本都被放置在纖維素

12、選擇培養(yǎng)基中，放在室溫下培養(yǎng)。3-5天后觀察菌絲生長(zhǎng)，形態(tài)，色素沉著和產(chǎn)孢。</p><p>　　2.6 纖維素酶生產(chǎn)的融合株，融合子和非親代菌株</p><p>　　該融合子，瑞氏木霉的非融合子與親代菌株進(jìn)行了檢查，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了胞外纖維素酶。CMCB的介質(zhì)組成（克 l- I蒸餾水）羧甲基纖維素鈉 5.0；NaN03，2.0；K2 HP04，1.0； KCI，0.5； MgS04，0.5和F

13、eS04，0.01，pH值6.5是用于培養(yǎng)瑞氏木霉。所有菌株生長(zhǎng)在50毫升的CMCB于250 mL錐形瓶中。每一瓶被接種1毫升分生孢子懸液（1x 107毫升分生孢子）和在室溫下放在100轉(zhuǎn)搖床中培養(yǎng)。一式三份瓶均保持相同的壓力。經(jīng)過(guò)6天的培養(yǎng)，用玻璃漏斗和濾紙過(guò)濾后以10,000 rpm4℃離心。在細(xì)胞發(fā)酵液被用作纖維素酶檢測(cè)酶的來(lái)源。</p><p><b>　　2.7 蛋白質(zhì)估計(jì)</b>

14、</p><p>　　培養(yǎng)濾液中的蛋白質(zhì)含量估計(jì)使用的染料布拉德福德結(jié)合的方法[12]。蛋白質(zhì)的數(shù)量，計(jì)算用牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)分?jǐn)?shù)（西格瑪化工有限公司，美國(guó)）。</p><p>　　2.8 纖維素酶檢測(cè)</p><p>　　該法是由0.1 ml培養(yǎng)液和0.9毫升含1％羧甲基纖維素（CMC）在100毫米檸檬酸鈉緩沖液（pH 5.0）制備的接種于55℃水浴中振蕩。控制，

15、沒(méi)有酶，底物和酶均維持煮沸。1 5分鐘后，還原糖反應(yīng)混合物中形成的硝基水楊酸，使用米勒[13]試劑法。一個(gè)單位酶活性定義為在標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)條件產(chǎn)生1微升CMC所使用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖糖是量。</p><p><b>　　3 結(jié)果</b></p><p>　　3.1 原生質(zhì)體的分離</p><p>　　里氏木霉菌絲體培養(yǎng)與裂解酶（西格瑪化工有限公司）導(dǎo)致細(xì)胞壁

16、和原生質(zhì)體釋放溶解。瑞氏木霉菌絲體溶解后2小時(shí)開(kāi)始初步觀察細(xì)胞含量。3小時(shí)后幾乎所有的菌絲體和原生質(zhì)體釋放完全（圖1）。剛剛公布的原生質(zhì)體的菌絲出的體積小，但后來(lái)他們慢慢地?cái)U(kuò)大到一個(gè)球形結(jié)構(gòu)。</p><p>　　3.2 原生質(zhì)體融合</p><p>　　將原生質(zhì)體用PEG溶液混合，觀察它們粘在一起時(shí)的變化。后來(lái)，在雙方的接觸處質(zhì)膜溶解原生質(zhì)體融合（圖2）。隨后，核原生質(zhì)體融合配對(duì)（同性配

17、子之互相融合）在許多情況下和某些情況下，對(duì)雙核階段進(jìn)行了觀察。最后，原生質(zhì)體融合成為單一的，大，圓形或橢圓形結(jié)構(gòu)。</p><p>　　3.3 再生融合和非融合原生質(zhì)體融合株菌株的選育</p><p>　　瑞氏木霉的原生質(zhì)體的融合開(kāi)始后2-3天（圖3）基菌絲體進(jìn)行選擇性培養(yǎng)。菌落經(jīng)過(guò)4天的生長(zhǎng)觀察2％纖維素酶的生長(zhǎng)狀況。菌絲生長(zhǎng)的基礎(chǔ)上，挑選15個(gè)快速增長(zhǎng)的瑞氏木霉融合子菌落，指定為SFT

18、rl- SFTr15。然而，3天后非融合原生質(zhì)體沒(méi)有在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。他們通常需時(shí)超過(guò)4天的生長(zhǎng)，原生質(zhì)體才較緩慢融合。一天之后兩個(gè)非融合子再生菌落會(huì)出現(xiàn)的選擇性培養(yǎng)基上并快速增長(zhǎng)，相對(duì)于其他群體，它們通常需要5天以上。這些被指定為NFTrl和NFTr2。</p><p>　　3.4 融合子，非融合子與親代菌株生長(zhǎng)的纖維素酶馬鈴薯培養(yǎng)基載體</p><p>　　所有15個(gè)融合子表現(xiàn)出的瑞氏木

19、霉菌絲菌落在PDA生長(zhǎng)大量孢子比非融合子與親代菌株茂盛。對(duì)其中突出的融合子，非融合子和親本的變化進(jìn)行了觀察。里氏木霉的融合子，非融合子與親代菌株在纖維素選擇培養(yǎng)基的增長(zhǎng)，不同菌株之間的周圍區(qū)域明顯不相似。最明顯的融合子區(qū)的外觀較大表明在這些融合子胞外纖維素酶產(chǎn)量高的水平。有趣的是融合子菌株在纖維素選擇培養(yǎng)基上與親本和非融合子相比菌絲生長(zhǎng)展出，色素沉著，產(chǎn)孢有很大區(qū)別。然而，我們觀察到非融合子和親本上述的特點(diǎn)有一些變化，但這些并不顯著。&

20、lt;/p><p>　　3.5 培養(yǎng)濾液中瑞氏木霉的親本，融合子和非融合子蛋白質(zhì)含量</p><p>　　在培養(yǎng)濾液中全部蛋白質(zhì)含量15個(gè)融合子介于54和78微克/毫升親本66微克/毫升，非融合株菌株毫升67和68微克/毫升。 最大的蛋白量估計(jì)在融合子SFTr1培養(yǎng)濾液中，最低在的融合子SFTr13培養(yǎng)濾液中（圖4）。</p><p>　　3.6 瑞氏木霉融合子的親本和

21、非融合子中的纖維素酶在在發(fā)酵液中含量</p><p>　　與非融合菌株（NFTr1和NFTr2）和親本PTr2相比，大多數(shù)融合子菌株（80％）SFTr14，SFTr13和SFTr15的纖維素酶的活性明顯增加?；钚宰畲笫侨诤献覵FTr2的培養(yǎng)液296單位/毫升/分鐘，最低是SFTr14的培養(yǎng)液（92單位/毫升/分鐘）。在15個(gè)菌株中與親本相比，超過(guò)三分之二的融合子菌株的纖維素酶的活性增加。有趣的是融合子SFTr2纖

22、維素酶活性比親本（圖5）的增加了2.6倍。</p><p><b>　　4 討論</b></p><p>　　原生質(zhì)體融合將是一個(gè)發(fā)展中的基因重組和優(yōu)良雜交種絲狀真菌的有效工具[6，11，14，1 5]。在目前的研究中，瑞氏木霉生產(chǎn)菌株P(guān)Tr2是用于內(nèi)部應(yīng)變程序與原生質(zhì)體融合提高外纖維素酶生產(chǎn)的目的。此前Das等人[16]證明了黑曲霉原生質(zhì)體基因重組融合的內(nèi)部通道。此

23、外，小川等 [1]取得了瑞氏木霉內(nèi)特異性雜交。8毫克的STC的緩沖液中加入0.6M的氯化鉀，作為瑞氏木霉的原生質(zhì)體提取裂解酶滲透壓穩(wěn)定劑。我們已經(jīng)優(yōu)化了釋放的絲狀真菌木霉等[17]原生質(zhì)體在我們的實(shí)驗(yàn)室中使用各種不同的排列組合。有趣的是，我們觀察到原生質(zhì)體釋放明顯受裂解酶濃度的影響。在低濃度，霉菌菌絲體溶解僅在尖端部分原生質(zhì)體，而在高濃度的，雖然有效地溶解的菌絲體，但原生質(zhì)體釋放后立即解體。在不同濃度的裂解酶下，我們發(fā)現(xiàn)最佳優(yōu)化的0.6

24、M的8毫克/毫升的氯化鉀作為滲透壓穩(wěn)定劑，木霉釋放的原生質(zhì)體數(shù)量較多。</p><p>　　T. harzianum 和T. longibrachiatum已經(jīng)做出了瑞氏木霉菌株原生質(zhì)體融合最佳濃度為40％聚乙二醇的報(bào)道[8]。不過(guò)，Pe'er和Chet [14]認(rèn)為種內(nèi)原生質(zhì)體融合技術(shù)應(yīng)為的33％聚乙二醇。PEG的濃度是高度有效的原生質(zhì)體融合的關(guān)鍵。高濃度的聚乙二醇易引起原生質(zhì)體的萎縮和爆破[5，17]

25、，濃度40至60％適合不同的真菌原生質(zhì)體融合。融合和非融合（控制）原生質(zhì)體接種于高濃度的選擇培養(yǎng)基中（2％）作進(jìn)一步的選擇。我們觀察到的融合子初期生長(zhǎng)速度慢于3天后菌絲生長(zhǎng)速度。不過(guò)，非原生質(zhì)體融合與3天后差別不大。他們通常需時(shí)超過(guò)4天的生長(zhǎng)原生質(zhì)體才緩慢的融合。一旦傳代培養(yǎng)。融合子在馬鈴薯培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度與非融合子和和親本相比非?？?，這表明在新環(huán)境中的融合株更快的適應(yīng)能力。所有的融合子菌株生長(zhǎng)旺盛，產(chǎn)生的孢子并比親本和非融合子多。

26、與融合株菌株黃色色素沉著強(qiáng)度相比，非融合子和親本高?，F(xiàn)在我們不僅觀察親本與非融合子菌株的一些變化。這些都不重要，因?yàn)橐呀?jīng)得到了我們的實(shí)驗(yàn)室報(bào)告[23]。</p><p>　　雖然瑞氏木霉的親本，融合子和非融合子菌株的羧甲基纖維素酶活相似。菌株周圍的菌絲體區(qū)域之間差異明顯。這突出了融合子的纖維素酶比非融合子和親本有較大的提高，這可能是直接關(guān)系到改善木霉菌株融合子。對(duì)兩個(gè)融合子菌株纖維素酶定量分析也證實(shí)了，其中酶的活

27、性增加了兩倍。雖然大多數(shù)已經(jīng)表明融合子菌株提高酶的活性，但也有些融合子與親本相比，表現(xiàn)出活性降低，。這表明，部分或不完整的基因重組過(guò)程中可會(huì)導(dǎo)致一些負(fù)面影響株融合子的地方。</p><p>　　本研究的結(jié)果清楚地表明原生質(zhì)體融合技術(shù)對(duì)工業(yè)發(fā)展的重要意義[6]。此外，內(nèi)瑞氏木霉菌株原生質(zhì)體融合造成了的纖維素酶活性增加，大部分的融合子菌株比原來(lái)增加了兩倍多。因此。這種技術(shù)可以成功地用于開(kāi)發(fā)，缺乏內(nèi)在的絲狀菌有性繁殖優(yōu)

28、良雜交品系。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] Ogawa K,Ohara H,Koide T,Toyama N.Intraspecific hybridization of T. reesei by protoplast fusion[J]. Ferment Bioeng 1989;67:207–9.</p>&

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