里氏木霉纖維素酶誘導(dǎo)表達(dá)過程中碳源感應(yīng)機(jī)制的研究.pdf

1、木質(zhì)纖維素是自然界中含量最為豐富的可再生資源，其高效循環(huán)利用將有效緩解日益嚴(yán)重的能源資源危機(jī)。由纖維素特殊的結(jié)構(gòu)組成所形成的天然抗降解屏障是制約其利用的主要瓶頸。自然界中存在許多纖維素降解微生物，它們能夠高效利用纖維素類底物，為纖維素的轉(zhuǎn)化利用提供了一條有效途徑。絲狀真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)便是纖維素降解微生物中的典型代表。
　　由于木質(zhì)纖維素為水不溶性底物，里氏木霉如何感應(yīng)胞外纖維素存在進(jìn)而觸發(fā)纖維素

2、酶基因表達(dá)以及纖維素來源的信號(hào)是如何被感應(yīng)和傳遞等問題至今沒有明確答案。本論文以里氏木霉纖維素酶誘導(dǎo)表達(dá)過程中碳源感應(yīng)為切入點(diǎn)，分別從纖維二糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和無轉(zhuǎn)運(yùn)活性的類纖維二糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白兩方面研究了纖維素酶編碼基因啟動(dòng)表達(dá)的機(jī)理，主要得到以下結(jié)果:
　　1.構(gòu)建了纖維二糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白篩選系統(tǒng)，并首次在里氏木霉中鑒定得到具有纖維二糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Stp1。
　　利用釀酒酵母不能代謝纖維二糖的特性，通過代謝工程的手段分別在釀酒酵母中

3、表達(dá)β-葡萄糖苷酶和候選纖維二糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并通過重組酵母以纖維二糖為碳源時(shí)的生長(zhǎng)情況判定候選轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是否具有纖維二糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性。以此重組酵母為平臺(tái)，結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)鑒定到了里氏木霉中第一個(gè)具有纖維二糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，由于它兼有葡萄糖和木糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性，因此將其命名為SugarTransporter1，簡(jiǎn)稱Stp1。
　　2.通過基因敲除證明里氏木霉Stp1不僅影響菌體對(duì)纖維二糖的利用，同時(shí)對(duì)里氏木霉纖維素酶基因的表達(dá)也有重要的影響

4、。
　　為研究纖維二糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在里氏木霉纖維素酶誘導(dǎo)表達(dá)中的作用，通過同源雙交換的策略在里氏木霉野生型菌株TU6中對(duì)stp1進(jìn)行敲除，成功得到Stp1缺失突變株△stp1。研究表明，Stp1的缺失一定程度上影響了里氏木霉對(duì)纖維二糖的利用，相比于野生型菌株，△stp1以纖維二糖為碳源時(shí)生長(zhǎng)變慢且最終生物量積累變少。并且Stp1的缺失致使里氏木霉在纖維素誘導(dǎo)時(shí)其纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄及發(fā)酵液纖維素酶酶活大幅度提升;而相反的是△stp1的纖維

5、素酶表達(dá)不再受纖維二糖的誘導(dǎo)。
　　進(jìn)一步分析表明Stp1缺失后對(duì)纖維二糖響應(yīng)的消失是由于胞外β-葡萄糖苷酶酶活升高引起，升高的β-葡萄糖苷酶酶活加速胞外纖維二糖水解，產(chǎn)生更多的葡萄糖從而引起葡萄糖阻遏效應(yīng)抑制纖維素酶基因的表達(dá)。但胞外β-葡萄糖苷酶酶活升高并不是纖維素誘導(dǎo)時(shí)△stp1菌株纖維素酶酶活升高的主要原因，且Stp1的缺失并不影響槐糖對(duì)纖維素酶的誘導(dǎo)。另外，研究還發(fā)現(xiàn)Stp1并不能解除纖維素為碳源時(shí)纖維素酶誘導(dǎo)過程中的葡

6、萄糖阻遏效應(yīng)，至少高濃度葡萄糖存在時(shí)Stp1并沒有明顯的解阻遏作用，考慮到Stp1所具備的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性，推測(cè)纖維素酶表達(dá)過程中Stp1的缺失可能通過減緩葡萄糖向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)而在一定程度上減緩了葡萄糖阻遏效應(yīng)的發(fā)生，因此使纖維素酶分泌表達(dá)加強(qiáng)。
　　3.通過表達(dá)譜測(cè)序，從全基因組水平上檢測(cè)了野生型菌株TU6和△stp1在纖維素誘導(dǎo)時(shí)的基因轉(zhuǎn)錄差異，發(fā)現(xiàn)一新的類糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Tr_3405，且其在△stp1中的轉(zhuǎn)錄得到上調(diào)。
　　為

7、更全面地研究△stp1高纖維素酶活的原因，對(duì)野生型菌株和△stp1菌株進(jìn)行了纖維素誘導(dǎo)下的表達(dá)譜測(cè)序。野生型菌株755個(gè)基因受Avicel誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，其中包括17個(gè)纖維素酶編碼基因和28個(gè)半纖維素酶編碼基因。受Avicel誘導(dǎo)上調(diào)的這些基因中有98個(gè)基因?yàn)榉置诘鞍拙幋a基因;21個(gè)預(yù)測(cè)為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子;31個(gè)基因編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其中這31個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中有17個(gè)與Stp1一樣屬于MFS超家族;還有30個(gè)基因與蛋白分泌有關(guān);另外的282個(gè)基因?qū)儆?/p>

8、未知功能蛋白編碼基因。整體表達(dá)譜測(cè)序結(jié)果顯示，△stp1中的基因表達(dá)譜與野生型菌株相比有697個(gè)基因的表達(dá)有明顯差別，其中包括139個(gè)表達(dá)上調(diào)基因和532個(gè)下調(diào)表達(dá)的基因。差異基因中預(yù)測(cè)為糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的MFS超家族的Tr3405受纖維素誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)十分顯著，而且其在△stp1中轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)一步升高。熒光定量PCR和Northern blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了Tr3405受纖維素誘導(dǎo)而發(fā)生上調(diào)表達(dá)。
　　4.通過過表達(dá)和基因敲除，證明類糖

9、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Tr_3405是里氏木霉纖維素酶誘導(dǎo)表達(dá)所必須的調(diào)節(jié)因子，將其命名為Cellulaseregulating transporter1，簡(jiǎn)稱Crt1。
　　熒光定量PCR結(jié)果顯示當(dāng)Tr_3405過表達(dá)時(shí)可以顯著提高纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄水平。進(jìn)一步通過同源雙交換策略對(duì)Tr_3405進(jìn)行敲除，發(fā)現(xiàn)Tr_3405的缺失致使里氏木霉不論是在纖維素、纖維二糖為底物還是槐糖誘導(dǎo)的條件下其纖維素酶均不再表達(dá)，由此說明Tr_3405是里氏木霉

10、纖維素酶誘導(dǎo)表達(dá)所必須的調(diào)節(jié)因子。
　　生物信息學(xué)分析顯示Tr_3405在進(jìn)化上與粗糙脈孢菌纖維二糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Cdt1和Cdt2及乳酸克魯維屬酵母乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Lacl2具有較高的一致性。但是纖維二糖和槐糖轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)表明Tr_3405并不具有纖維二糖或槐糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性。因此，Tr_3405可能是以無轉(zhuǎn)運(yùn)活性類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的形式參與胞外誘導(dǎo)信號(hào)的感應(yīng)。由此，我們將Tr_3405蛋白命名為類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白纖維素酶調(diào)節(jié)因子(Cellulase regula

11、tingtransporter1，簡(jiǎn)稱Crt1)。通過pull-down實(shí)驗(yàn)釣取了與Crt1相互作用的蛋白，進(jìn)一步研究Crt1的信號(hào)感應(yīng)與傳遞的分子機(jī)制，初步結(jié)果表明Crt1的C端并不穩(wěn)定，這可能與Crt1的信號(hào)傳遞功能有關(guān)，更深入的實(shí)驗(yàn)結(jié)果待進(jìn)一步分析。
　　5.發(fā)現(xiàn)了一種新型纖維素酶誘導(dǎo)碳源—葡萄糖酸內(nèi)酯。
　　本論文研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖酸內(nèi)酯擁有略高于纖維二糖的纖維素酶誘導(dǎo)效果，且能夠作為唯一碳源供里氏木霉生長(zhǎng)，這是迄今為止

12、發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)單糖衍生物類的纖維素酶誘導(dǎo)物。研究表明，葡萄糖酸內(nèi)酯誘導(dǎo)纖維素酶表達(dá)需要Crt1和纖維素酶基因關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Xyr1的參與，不論是Crt1還是Xyr1的缺失都會(huì)消除葡萄糖酸內(nèi)酯對(duì)纖維素酶的誘導(dǎo)表達(dá)。進(jìn)一步研究表明，胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶Cella在葡萄糖酸內(nèi)酯誘導(dǎo)纖維素酶表達(dá)過程中至關(guān)重要，它的缺失致使菌體在葡萄糖酸內(nèi)酯誘導(dǎo)下其纖維素酶不再表達(dá)，而胞外β-葡萄糖苷酶Bgl1并不影響葡萄糖酸內(nèi)酯的誘導(dǎo)。與纖維素的誘導(dǎo)不同，葡萄糖酸內(nèi)

13、酯誘導(dǎo)纖維素酶的表達(dá)受Stp1正調(diào)控，Stp1的缺失會(huì)大幅度削弱葡萄糖酸內(nèi)酯為碳源時(shí)纖維素酶的表達(dá)水平，初步試驗(yàn)證明這與Stp1的轉(zhuǎn)運(yùn)活性有關(guān)。
　　本論文發(fā)現(xiàn)了里氏木霉中第一個(gè)纖維二糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Stp1并首次報(bào)道了纖維素酶表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵類纖維二糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Crt1，這為后續(xù)的纖維素酶表達(dá)調(diào)控過程中碳源感應(yīng)的研究提供了良好的開端。綜合以上結(jié)果初步得到以下模型:環(huán)境中的纖維素類底物，在本底表達(dá)的纖維素酶作用下釋放微量的纖維二糖，這些纖維

14、二糖與定位于細(xì)胞膜上的Crt1相結(jié)合后形成的纖維素酶誘導(dǎo)信號(hào)經(jīng)下游信號(hào)途徑的傳遞最終進(jìn)入細(xì)胞核激活纖維素酶的表達(dá)。Stp1是位于細(xì)胞膜上的纖維二糖/葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其缺失突變?cè)斐勺畛跣纬傻奈⒘坷w維二糖在胞外積累加強(qiáng)了Crt1參與的纖維素酶誘導(dǎo)信號(hào)的產(chǎn)生，促進(jìn)了纖維素誘導(dǎo)下纖維素酶的表達(dá);纖維素酶表達(dá)啟動(dòng)后胞外產(chǎn)生的纖維二糖一部分被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入胞內(nèi)另一部分在胞外被水解成少量的葡萄糖，Stp1的缺失抑制了葡萄糖向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)也相應(yīng)抑制了葡萄糖阻遏