牛免疫缺陷病毒微管依賴性運(yùn)輸?shù)难芯?pdf

1、牛免疫缺陷病毒(BIV)屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬,與人免疫缺陷病毒(HIV)在形態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)方面具有很高的同源性。BIV是一種非致癌病毒,在感染的牛群體內(nèi),誘發(fā)中樞系統(tǒng)損傷和白細(xì)胞增生；在體外培養(yǎng)細(xì)胞中,誘導(dǎo)合胞體的產(chǎn)生。與其他慢病毒相同,BIV感染細(xì)胞后將自身RNA基因組反轉(zhuǎn)錄成為DNA,并以原病毒形式整合到宿主染色體。病毒是細(xì)胞的嚴(yán)格寄生物,必須借助宿主細(xì)胞的機(jī)制完成自身的各種生命活動(dòng)。在感染早期,病毒顆粒需要從細(xì)胞邊緣移動(dòng)到細(xì)胞核

2、附近進(jìn)而完成復(fù)制。通過劫持馬達(dá)蛋白沿著微管運(yùn)動(dòng),是病毒運(yùn)輸?shù)钠毡闄C(jī)制。作為細(xì)胞的通道,微管是平行排列的αβ微管蛋白二聚體構(gòu)成的管狀結(jié)構(gòu),兩端具有極性。在非極性細(xì)胞中,微管正極指向細(xì)胞膜,負(fù)極指向微管組織中心。病毒從細(xì)胞邊緣到細(xì)胞核的運(yùn)動(dòng)是向微管負(fù)極的運(yùn)輸,稱為反向運(yùn)輸,常需要?jiǎng)恿Φ鞍?dynein)的參與；病毒從細(xì)胞核周到細(xì)胞邊緣的運(yùn)動(dòng)是向微管正極的運(yùn)輸,稱為正向運(yùn)輸,需要驅(qū)動(dòng)蛋白的參與。病毒蛋白與馬達(dá)蛋白亞基的相互作用被認(rèn)為是病毒運(yùn)輸

3、的關(guān)鍵。
　　 本文利用指示細(xì)胞的方法檢測(cè)微管藥物對(duì)BIV感染的影響,發(fā)現(xiàn)BIV在nocodazole處理過的細(xì)胞中的感染性顯著下降,nocodazole對(duì)BIV感染的抑制作用發(fā)生在感染早期并且具有劑量依賴性。通過微管組分分離實(shí)驗(yàn)和對(duì)微管蛋白乙?；臋z測(cè),發(fā)現(xiàn)BIV感染可以促進(jìn)微管的聚合與穩(wěn)定。為了進(jìn)一步確定微管是否參與BIV的運(yùn)輸,通過免疫熒光顯微鏡觀察了病毒顆粒在不同感染時(shí)期的亞細(xì)胞定位。感染后2小時(shí),BIV病毒顆粒幾乎都位

4、于細(xì)胞邊緣,感染8小時(shí)后移動(dòng)到細(xì)胞核附近。而在nocodazole處理的細(xì)胞中,大部分病毒顆粒在感染后8小時(shí)仍定位于細(xì)胞邊緣。對(duì)病毒顆粒的定量分析顯示,與正常細(xì)胞相比,nocodazole使細(xì)胞核區(qū)病毒顆粒數(shù)目明顯下降。此外,在免疫熒光顯微鏡和電鏡下,我們觀察到正在運(yùn)輸?shù)牟《绢w粒定位在微管上。這些結(jié)果證明BIV的反向運(yùn)輸依賴于微管。利用過表達(dá)Dynamitin使dynein功能受損的方法,檢測(cè)了dynein是否參與BIV的生活周期。在D

5、ynamitin過表達(dá)的細(xì)胞中,BIV的感染性顯著下降。進(jìn)一步免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明了BIV感染性的下降是由于病毒顆粒反向運(yùn)輸受阻造成的。這些結(jié)果證明dynein是介導(dǎo)BIV反向運(yùn)輸?shù)鸟R達(dá)蛋白。利用酵母雙雜交篩選,我們發(fā)現(xiàn)BIV衣殼蛋白CA與dynein輕鏈亞基LC8存在相互作用；通過GST-pulldown、CBP-pulldown和Co-IP實(shí)驗(yàn),證明CA在體內(nèi)、體外和病毒感染條件下均可以與LC8相互作用。在CA蛋白中,LC8結(jié)合區(qū)位于C

6、A蛋白N端結(jié)構(gòu)域。向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染短發(fā)夾RNA可以下調(diào)LC8的表達(dá)。BIV在LC8受損的細(xì)胞中感染性顯著下降。在免疫熒光顯微鏡下,這些細(xì)胞中BIV的反向運(yùn)輸被阻斷。微管組分分離實(shí)驗(yàn)顯示,在BIV感染早期,正常細(xì)胞中CA蛋白主要存在于微管組分中,而在LC8受損細(xì)胞中CA蛋白多存在于細(xì)胞漿中。進(jìn)一步的Co-IP實(shí)驗(yàn)證明CA可以通過LC8結(jié)合到dynein復(fù)合物上,這一結(jié)果與熒光顯微鏡下觀察到運(yùn)輸中的病毒顆粒與GFP標(biāo)記的dynein復(fù)合物具有共

7、定位的現(xiàn)象相一致。此外,過轉(zhuǎn)染CA可以有效抑制 BIV的感染,這可能是由于過剩的CA蛋白與病毒競爭性結(jié)合LC8導(dǎo)致的。以上結(jié)果證明LC8是BIV運(yùn)輸中連接病毒顆粒與微管的關(guān)鍵因子。本文首次描述了微管依賴性的BIV反向運(yùn)輸,并闡明了BIV運(yùn)輸?shù)姆肿訖C(jī)制,豐富了人們對(duì)BIV生活周期的認(rèn)識(shí)。通過BIV運(yùn)輸分子基礎(chǔ)的揭示,對(duì)HIV乃至整個(gè)反轉(zhuǎn)錄病毒的相關(guān)研究具有重要的借鑒意義。所有慢病毒的研究都是以攻克艾滋病為最終目標(biāo)的,我們從病毒反向運(yùn)輸這個(gè)