IBDV弱毒株在囊B細(xì)胞上的適應(yīng)分析及HeYD的分離鑒定.pdf

1、傳染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)是雙鏈RNA病毒，感染雛雞法氏囊B淋巴細(xì)胞。經(jīng)典的IBDV毒株可感染3到6周齡的雛雞，會造成免疫缺陷，進(jìn)而引起其它病原的感染，并出現(xiàn)高死亡率。而IBDV超強(qiáng)毒株(vvIBDV)可以直接使雛雞死亡，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。同時，IBDV還可以使其它疫苗的作用大大下降。
　　 IBDV是雙節(jié)段雙鏈無囊膜RNA病毒，屬于雙RNA病毒科，禽類雙RNA

2、病毒屬。病毒顆粒是直徑約為60nm的二十面體，而且IBDV，共編碼5種病毒蛋白，分別是VP1、VP2、VP3、VP4和VP5。其中，VP2是IBDV的主要的結(jié)構(gòu)蛋白，是IBDV含量最多，且最重要的結(jié)構(gòu)蛋白，影響病毒著病毒的多項(xiàng)功能，對于病毒毒力和細(xì)胞嗜性有著非常重要的影響。在病毒防治方面，VP2作為主要抗原可以使機(jī)體對IBDV病毒產(chǎn)生保護(hù)性抗體。IBDV VP2蛋白的高變區(qū)，具有毒力特征氨基酸位點(diǎn)，而且存在著高度變異的可能性。
　

3、　 本實(shí)驗(yàn)用的兩株IBDV弱毒株TAD和HN3，通過細(xì)胞培養(yǎng)將病毒在細(xì)胞上傳代，使病毒適應(yīng)DT40，CEF細(xì)胞，獲得可以穩(wěn)定增殖的細(xì)胞適應(yīng)毒株。RT-PCR擴(kuò)增VP2蛋白高變區(qū)基因，克隆后測序，將測序結(jié)果進(jìn)行相互比對，并且與一些不同毒力的代表毒株進(jìn)行比對。結(jié)果表明適應(yīng)毒株序列與原始毒株序列有一定差異，可能是病毒在適應(yīng)細(xì)胞過程中發(fā)生的一些變異。
　　 由于VP2重要作用，且其高變區(qū)的高度變異性，本實(shí)驗(yàn)針對細(xì)胞適應(yīng)毒株和原始毒株V

4、P2高變區(qū)基因的核苷酸和氨基酸序列，進(jìn)行比對分析，進(jìn)一步了解病毒適應(yīng)過程中的變異情況，進(jìn)而分析出那些氨基酸殘基對于病毒細(xì)胞嗜性有重要影響。
　　 本實(shí)驗(yàn)從GenBank中選擇4株不同毒力毒株的 VP2高變區(qū)基因序列，同原始毒株以及它們的適應(yīng)毒株，以NJ(Neighbor Joining)法，使用MEGA3.1構(gòu)建核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)化樹，對它們的VP2高變區(qū)基因進(jìn)行進(jìn)化分析。使用DNAstar中的MegAlin分別對兩株原始

5、弱毒和不同細(xì)胞上的適應(yīng)毒進(jìn)行比對，從而清楚地了解適應(yīng)過程中序列核苷酸和氨基酸變化頻率及核苷酸和氨基酸位點(diǎn)的突變情況。結(jié)果表明DT40細(xì)胞適應(yīng)毒株與原始毒株存在很小的差異，核苷酸序列差異性不超過1％，氨基酸序列差異性也不超過10％，而CEF上的適應(yīng)株VP2序列完全沒有變化。與原始毒株相比，DT40細(xì)胞適應(yīng)毒株最都只有4個核苷酸位點(diǎn)發(fā)生替換，氨基酸位點(diǎn)最多發(fā)生3個替換。適應(yīng)株發(fā)生替換的位點(diǎn)均不是IBDV毒力的關(guān)鍵位點(diǎn)，而且替換氨基酸不是脯氨

6、酸一些特別氨基酸，故對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響并不是很大。而且CEF適應(yīng)株VP2高變區(qū)核苷酸序列和氨基酸序列都沒有發(fā)生變化，可能是VP2其它位點(diǎn)或其它基于發(fā)生變化引起的細(xì)胞適應(yīng)。
　　 對河南新近分離的IBDV疑似超強(qiáng)毒株HeYD進(jìn)行了基因克隆及序列分析，并與其它參考毒株高變區(qū)進(jìn)行序列比對。序列分析結(jié)果表明，該分離株的VP2高變區(qū)具有IBDV超強(qiáng)毒株典型的氨基酸序列特征。利用VP2基因高變區(qū)序列構(gòu)建基因進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)HeYD毒株與國內(nèi)超強(qiáng)