熒光原位雜交檢測尿脫落細胞染色體異常診斷膀胱腫瘤的研究

1、<p>　　熒光原位雜交檢測尿脫落細胞染色體異常診斷膀胱腫瘤的研究</p><p>　　王 鵬，靳風爍，葉 錦，吳 剛，李彥鋒，張 堯，梁 平 （第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所泌尿外科，重慶 400042）</p><p>　　摘 要：目的 本研究旨在探討通過熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)檢測

2、3、7、9、17號染色體數(shù)目畸變診斷國人膀胱尿路上皮癌的可行性和有效性。方法 采用3、7、17 號染色體著絲粒探針和9p21區(qū)帶探針對140例觀察者尿液脫落細胞核行熒光原位雜交，并同時行經(jīng)腹部超聲和尿脫落細胞學檢查，以膀胱鏡病理檢查確診，比較分析各種方法的敏感性和特異性。結(jié)果 ⑴ 腫瘤組80例膀胱尿路上皮癌全部經(jīng)病理檢查確診，其中68例FISH結(jié)果陽性，26例尿脫落細胞學陽性，71例經(jīng)腹部超聲診斷為膀胱癌。⑵ 非腫瘤對照組30例，其

3、中29例FISH結(jié)果陰性，1例假陽性；尿脫落細胞學檢查全部陰性；經(jīng)腹超聲檢查23例陰性，7例假陽性。FISH、尿脫落細胞學、經(jīng)腹部超聲的靈敏度分別為85.00%、32.50%、88.75%，特異度分別為96.67%、100.00%、76.67%。結(jié)論 使用FISH技術檢測尿脫落細胞3、7、9、17號染色體數(shù)目畸變，具有敏感度高、特異性強的優(yōu)點，并具無創(chuàng)性，對國人膀胱尿路上皮癌的診斷具有重要的臨床應用價值。</p><

4、;p>　　關鍵詞：膀胱腫瘤；原位雜交；診斷</p><p>　　中圖法分類號：R737.14 文獻標識碼：A</p><p>　　The study on urine exfoliated cell chromosome aberration detected by fluorescence in situ

5、 hybridization of the bladder </p><p>　　Wang Peng, Jin Feng-shuo Ye Jin, Wu Gang, Li Yan-feng, Zhang Yao, Liang Ping (Department of Urology, The Third Affiliated Hospital of Third Military Medicial Universit

6、y, Chongqing 400042, China)</p><p>　　Abstract：Objective The aim of this study was to evaluate the possibility and validity of detecting numerical aberration of chromosome 3,7,9,17 by fluorescence in situ hyb

7、ridization (FISH) in detecting urothelial carcinoma of bladder in Chinese. Mehtods 140 volunteers were recruited as subjects. Exfoliated cells from fresh urinary specimen was collected and the cell was examined by FISH u

8、sing centromeric probes of chromosome 3,7,17 and region probe of 9p21. Cytology and transabdominal ultrasonogr</p><p>　　Key words：Bladder neoplasm; In situ hybridization; Diagnosis</p><p>　　膀胱癌是

9、我國泌尿男性生殖系最常見的惡性腫瘤,其中尿路上皮癌占90%以上。目前，經(jīng)腹部泌尿</p><p>　　基金項目：衛(wèi)生部科研基金（WKJ2007-3-001）</p><p>　　Supported by the Research Funds of the ministry of health（WKJ2007-3-001）</p><p>　　作者簡介：王 鵬，男，

10、河南省駐馬店市人，碩士研究生，醫(yī)師，主要從事膀胱腫瘤疾病方面的研究。電話：13658336305，E-mail：Wodeyouxiang2006131@126.com</p><p>　　通信作者：靳風爍，電話：（023）68757946，E-mail：jinfs5505@163.com</p><p>　　收稿日期：2009-02-12；修回日期：2009-03-16</p>

11、<p>　　系超聲檢查、膀胱鏡檢查、尿脫落細胞學及尿液</p><p>　　腫瘤標記物的檢測是用于發(fā)現(xiàn)和監(jiān)測膀胱癌普遍使用的4種手段。然而，尿脫落細胞學檢測敏感性太低，膀胱鏡則為有創(chuàng)檢查，患者痛苦，難以接受，對于肉眼見不到的腫瘤診斷也存在困難。經(jīng)腹超聲檢查較尿脫落細胞學檢查診斷敏感性高，但特異性差，且易受膀胱內(nèi)血凝塊、腫瘤大小及位置的影響而導致假陽性或假陰性的診斷結(jié)果。尿液腫瘤標志物檢測多用于膀胱腫

12、瘤的篩查，易受血尿、尿路感染、膀胱灌注治療的影響而出現(xiàn)假陽性結(jié)果，不能成為可靠的診斷指標。因此,人們一直在探索更為有效、簡便、安全的診斷尿路上皮癌的方法。</p><p>　　近年來，隨著對膀胱癌遺傳學改變的深入研究，發(fā)現(xiàn)9號染色體部分（如p16位點）或全部丟失是最常見遺傳學改變，且膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展與3號、7號及17號染色體的非整倍性密切相關。初步臨床研究顯示，對尿液中脫落細胞進行以上遺傳學改變的檢測對膀胱尿路

13、上皮癌的診斷及預后評估具有很大意義[1,2]。我國學者有關膀胱癌遺傳學研究表明,中國人與西方人膀胱癌的遺傳學背景存在一定的差異[3],用FISH 技術檢測3、7、9、17號染色體異常對中國人膀胱尿路上皮癌的診斷價值仍不明了。</p><p>　　本研究采用FISH技術檢測140例觀察者尿脫落細胞核3、7、9、17號染色體，并與經(jīng)腹部超聲、膀胱鏡、尿脫落細胞形態(tài)學檢測膀胱腫瘤的方法比較，以探討FISH技術在膀胱癌診

14、斷中的應用價值。</p><p><b>　　1 資料與方法</b></p><p>　　1.1 受檢者資料及分組</p><p>　　1.1.1 腫瘤組 80例膀胱尿路上皮癌血尿患者，其中男性58例，女性22例，年齡26～83歲。根據(jù)膀胱腫瘤2002 TNM分期系統(tǒng)和 WHO 2004分級法，腫瘤的臨床病理情況：Ta 17例，T1

15、 29例，T2 21例，T3 8例，T4 5例；G1 35例，G2 25例，G3 20例。</p><p>　　1.1.2 正常對照組 30例正常人。其中男性15例，女性15例，年齡20～60歲。</p><p>　　1.1.3 非腫瘤對照組 30例同期治療的血尿患者，包括：腺性膀胱炎患者10例，良性前列腺增生患者10例，慢性膀胱炎患者10例。其中男性19例，女性11例，年

16、齡29～81歲。</p><p><b>　　1.2 診斷方法</b></p><p>　　所有受檢者均行經(jīng)腹部泌尿系超聲檢查、尿脫落細胞學和FISH檢測，腫瘤組及非腫瘤對照組以膀胱鏡病理檢查確診。每例患者于膀胱鏡檢查前或手術前連續(xù)3d收集新鮮尿液，每次300ml左右，將每例尿樣分為2份，分別行尿液脫落細胞學常規(guī)檢查和尿液脫落細胞FISH檢測。腫瘤組及非腫瘤對照組經(jīng)

17、膀胱鏡活檢或手術治療取得組織標本，并送病理科常規(guī)石蠟切片，由同一病理科醫(yī)師判讀切片結(jié)果。</p><p><b>　　1.3 實驗方法</b></p><p>　　FISH技術使用的3、7、17 號染色體著絲粒探針和9p21區(qū)帶探針購自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司。3號、17號染色體著絲粒探針為綠色熒光信號，7號染色體著絲粒探針和雜交到9號染色體長臂（9p21）的P1

18、6探針為桔紅色熒光信號。收集受檢者新鮮尿液后分為2份，1份按照試劑盒說明書方法進行FISH實驗操作，另1份離心涂片，HE染色尋找腫瘤細胞[4]。</p><p>　　1.4 判斷標準及結(jié)果分析</p><p>　　熒光顯微鏡下觀察，通過FISH點計數(shù)分析2.0軟件控制的CCD攝取圖像，每組探針分析100～200個細胞。結(jié)果判斷的標準：判定單體的標準為單個信號的核比例＞15%；3倍體及多倍

19、體的標準為3個及多個信號的核＞10%細胞總數(shù)。組合探針陽性判定標準參照UroVysion推薦標準[5]：至少在4個細胞中同時存在3、7、17中的2個染色體的擴增，或至少在12個細胞中存在9p21純合性缺失。尿脫落細胞學以發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞為陽性，其余為陰性。根據(jù)診斷實驗配對四格表和計算公式[6]，靈敏度＝真陽性/（真陽性＋假陰性），特異度＝真陰性/（假陽性＋真陰性）。</p><p>　　1.5 統(tǒng)計學分析</

20、p><p>　　所有資料均使用SPSS 13.0軟件，采用χ2檢驗。</p><p><b>　　2 結(jié)果</b></p><p>　　在正常人和非尿路上皮癌患者中，F(xiàn)ISH結(jié)果顯示各探針表現(xiàn)為2紅、2綠2個雜交信號（圖1）。在尿路上皮癌患者中，F(xiàn)ISH結(jié)果可見不同程度的染色體數(shù)目異常（圖2）。30例正常人FISH及尿脫落細胞學檢測結(jié)果均為陰性。

21、病例組、對照組各項診斷結(jié)果見表1（圖3、圖4）。本研究中FISH診斷膀胱尿路上皮癌的靈敏度與經(jīng)腹部超聲檢查相似（χ2=0.493，P =0.482），低于膀胱鏡檢查（χ2=12.973，P =0.000），顯著優(yōu)于尿脫落細胞學（χ2=45.493，P =0.000）；特異性接近尿脫落細胞學（χ2=1.017，P =0.313）和膀胱鏡檢查（χ2=1.017，P =0.313），優(yōu)于經(jīng)腹部超聲檢查（χ2＝5.192，P =0.023）（表

22、2）。使用FISH技術診斷膀胱尿路上皮癌，Ta、T1、T2、T3、T4 的靈敏度分別為：64.70%（11/17）、86.21%（25/29）、95.24%（20/21）、87.50%（7/8）、100.00%（5/5），Ta 與T1 -T4相比敏感性較低。尿脫落細胞學檢測Ta腫瘤的靈敏度為11.76%（2/17），與FSIH相比有較顯著的差異（</p><p><b>　　3 討論</b>

23、;</p><p>　　FISH技術是分子細胞遺傳學最常使用的研究手段之一，其主要用于染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)畸變的研究。FISH技術的發(fā)展使得細胞遺傳學與分子遺傳學緊密</p><p>　　地結(jié)合在一起，既可顯示中期染色體，也可以顯示間期核中的染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)上的異常，而染色體分析已被認為是許多惡性腫瘤的診斷和預后指標之一。在本研究當中，F(xiàn)ISH技術采用熒光標記的核酸探針檢測3、7、17、9p2

24、1號染色體，以確定有無與膀胱癌相關的非整倍體來診斷膀胱尿路上皮癌。國外文獻報道膀胱尿路上皮癌患者9p21的純合性缺失率高達83.00%[7]，研究表明9p21含有重要的抑癌基因p16，與細胞周期調(diào)控有關，不論是純合性缺失還是單體，都意味著遺傳物質(zhì)的缺失，這可能對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起重要作用，所以有人認為9p21缺失是尿路上皮癌早期最常見的改變之一，其有可能作為早期診斷和監(jiān)測復發(fā)的重要分子標志。Veeramachaneni等[8]報道3號染

25、色體多倍體高達76.00%，定位于3p25的RAFI基因過表達與膀胱尿路上皮癌的病理分級相關[9]。7號染色體多倍體發(fā)生率大約為76.20% [7]，Sauter等[10]認為7號染色體多倍體與病理分期、分級顯著相關，7號染色體畸變可能在膀胱尿路上皮癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。Gallicci等[11]研究表明，17號染色體畸變率為74.00%，17號</p><p>　　目前，膀胱鏡活檢組織病理檢查為診斷膀胱癌的

26、金標準，尿脫落細胞學、經(jīng)腹部超聲檢查、尿核基質(zhì)蛋白22( NMP22)、膀胱腫瘤抗原(BTA)及ImmunoCyt 等腫瘤標記物是發(fā)現(xiàn)和檢測膀胱癌的常用方法。但膀胱鏡為有創(chuàng)檢查，嚴重時可導致出血、膀胱穿孔等并發(fā)癥，患者常不愿接受，對于處于泌尿系統(tǒng)急性感染期、尿道狹窄、膀胱容量過小、出血性疾病、女性月經(jīng)期及不能接受膀胱截石體位的患者無法行膀胱鏡檢查。膀胱鏡的視野也有一定的盲區(qū)，如膀胱頸部，尤其是近12點處，因而用于篩查膀胱癌患者受到很大限

27、制。尿脫落細胞學檢查方便、簡單、無創(chuàng)、特異性高，但靈敏度太低，文獻報道陽性率為20%～30%。在本研究中，盡管我們對細胞學檢查給予了足夠的重視，其陽性率也只有32.50%，這些結(jié)果都提示僅依賴細胞學檢查會造成大量患者漏診。另外，尿標本中細胞不典型或退行性變、泌尿系感染、結(jié)石以及膀胱灌注治療等也可導致尿脫落細胞學診斷困難。經(jīng)腹部泌尿系超聲檢查經(jīng)濟、簡單、無創(chuàng)、靈敏度較高，可重復性強，已成為膀胱癌的常規(guī)檢查方法，但其特異性較低，且對于非隆起

28、性病灶及直徑小于0.5cm的腫瘤，超聲難以發(fā)現(xiàn)，位于膀胱頂部及前壁的腫瘤因易受</p><p>　　從本研究中可以看出，隨著腫瘤級別的增高，F(xiàn)ISH 的靈敏度也隨之升高，F(xiàn)ISH對G3的靈敏度高于G1（χ2=4.420，P =0.036），對G2的靈敏度也高于G1（χ2=5.881，P =0.015），但G3與G2比較無顯著性差異（χ2=0.026，P =0.872），可能是由于隨著腫瘤級別升高，腫瘤細胞內(nèi)染色體

29、畸變率增高，腫瘤細胞容易脫落的緣故。張業(yè)貴等[5]采用FISH技術對57例膀胱尿路上皮癌進行研究，也發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤級別升高，陽性率增高，因使用標本為手術中切除的新鮮膀胱尿路上皮癌組織的細胞，所以只能用于術后研究，不能用于術前診斷。Ta 與T1-T4相比敏感性較低，流式細胞儀分析Ta期膀胱腫瘤90%為2倍體，比較基因組研究顯示高分化Ta較少有基因變異，這些可以解釋FISH技術不能發(fā)現(xiàn)部分Ta期膀胱尿路上皮癌患者。此外尿量不夠、低腫瘤負荷、腫

30、瘤細胞脫落較少也可能對敏感性有影響。</p><p>　　本研究證實，使用尿脫落細胞熒光原位雜交技術檢測3、7、9、17號染色體數(shù)目畸變診斷國人膀胱尿路上皮癌，具有敏感度高、特異性強的優(yōu)點，并具無創(chuàng)性，尤其對早期尿路上皮癌患者有輔助診斷作用，對膀胱癌的診斷具有重要的臨床應用價值。</p><p><b>　　參考文獻：</b></p><p>

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