熒光原位雜交技術(shù)在大白菜染色體基因定位中的應(yīng)用研究.pdf

1、大白菜不僅是起源于中國的重要的蔬菜作物，而且是多國蕓薹屬基因組計劃的主要研究對象之一?；蚨ㄎ皇腔蜩b定、克隆和利用的基礎(chǔ)和前提。在分子細胞遺傳學(xué)研究領(lǐng)域，利用非整倍體材料和熒光原位雜交技術(shù)手段進行基因的物理定位，日益成為基因定位研究的熱點，這對物理圖譜的繪制、建立遺傳連鎖群和特定染色體的對應(yīng)關(guān)系以及遺傳圖譜和物理圖譜的整合具有重要的意義。本研究以大白菜二倍體和本課題組創(chuàng)制的一套大白菜初級三體為材料，采用染色體核型分析的方法對繼代繁殖多

2、代的不同三體和二倍體的遺傳穩(wěn)定性進行了細胞學(xué)鑒定，采用FISH技術(shù)對兩個rDNA重復(fù)序列基因和通過PCR擴增、克隆獲得的幾個功能基因片段進行了物理定位。主要研究結(jié)果如下： 1.通過對FISH的相關(guān)技術(shù)參數(shù)的研究，建立了大白菜染色體制備和制片預(yù)處理、探針雜交、雜交后洗脫以及信號檢測的技術(shù)體系。以重復(fù)序列45SrDNA為探針，利用該體系在大白菜中期和間期染色體上成功檢出了10個熒光強度強弱不同的雜交信號，為熒光原位雜交技術(shù)在大白菜上

3、的利用奠定了基礎(chǔ)。以幼嫩子葉為材料，采用低溫刀切的方法，改進了fiber-FISH技術(shù)過程中細胞核的提取方法，成功的制備出了平滑伸展的DNA纖維，大白菜基因組探針在DNA纖維上雜交，雜交信號為非連續(xù)的念珠狀長鏈。 2.核型分析表明，大白菜染色體核型公式為2n=2x=20=10m+8sm+2st(SAT)，核型類型為2B。1號、2號、4號、5號、7號為中部著絲點染色體；3號、6號、8號、9號染色體為近中部著絲點染色體；10號染色體

4、為近端部著絲點染色體。DAPI顯帶結(jié)果表明深染區(qū)多集中在著絲粒兩側(cè)附近，同源染色體的帶紋數(shù)目、分布位置基本一致。 3.通過對大白菜組培苗根尖細胞有絲分裂染色體數(shù)目觀察，發(fā)現(xiàn)長期繼代保存的一些材料存在著染色體數(shù)目的變異；但對不同三體進行核型分析可知，染色體數(shù)目未變異的三體株系仍為最初確定的三體，沒有發(fā)生染色體的置換。 4.擬南芥25SrDNA在二倍體大白菜中期染色體上的FISH定位表明存在著5個25SrDNA的同源區(qū)段，它

5、們分別位于1號、2號、3號、4號和10號五對染色體上，雜交信號在不同染色體上的熒光強度不同。利用DNAfiber-FISH技術(shù)確定了25SrDNA在大白菜基因組中的拷貝數(shù)約為566±137。但25SrDNA在大白菜不同初級三體上檢出的雜交信號的個數(shù)在7-12個之間變化，分布于4-7個同源區(qū)段上。綜合分析可以看出，在不同三體的1～4號染色體的長臂及10號染色體的隨體(包括次縊痕處)上均存在相應(yīng)的25SrDNA的同源區(qū)段，但雜交信號在不同三

6、體同一染色體上檢出的頻率不同，熒光信號強度也有變化，最強的信號出現(xiàn)在不同三體的＃10隨體染色體上(triplo4，triplo5除外)。 5.5SrDNA在二倍體大白菜檢出了6個雜交信號，分別位于2號染色體的長臂、9號和10號染色體的短臂三對同源染色體上；在triplo2、triplo3和triplo9三個三體上分別檢出了7個、6個和7個雜交信號，這些信號所屬的染色體和在染色體上分布的位置與二倍體相同。利用DNAfiber-FI

7、SH技術(shù)確定了5SrDNA在大白菜基因組中的拷貝數(shù)約為679。 6.利用25S和5SrDNA為探針，可以準確識別大白菜1號、2號、3號、4號、9號和10號染色體。 7.通過PCR擴增、克隆獲得了14個大白菜功能基因同源片段，根據(jù)其片段長度分別命名為EPSP1409、RGA944、SLG773、BccLH904、RPS2671、SALM742、VDAC994、CYP954、BcNCED1453、BcGR803、ME725、

8、SIL1445、BID733、FLC909；序列比對結(jié)果表明所獲的這些基因同源片段的核苷酸序列與供選基因的核苷酸序列高度同源(BcGR803除外)，范圍在89﹪～99﹪。EPSP1409、RGA944、RPS2671和CYP954四個探針各在二倍體大白菜一對染色體上檢出了FISH雜交信號，分別位于3S中部、3L中部、2L末端以及1L中部，盡管四個探針信號檢出率都較低，平均為6.48﹪，但低拷貝基因在大白菜染色體上的定位尚屬首次，為大白菜