水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)畢業(yè)論文-常見中草藥對鱉源致病性嗜水氣單胞菌的體外抑制效應(yīng)

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　　（20 屆）</b></p><p>　　常見中草藥對鱉源致病性嗜水氣單胞菌的體外抑制效應(yīng)</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級

2、 水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué) </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目錄</

3、b></p><p>　　中文摘要…………………………………………………………………………… 1</p><p>　　英文摘要…………………………………………………………………………… 2</p><p>　　1.前言……………………………………………………………………………… 3</p><p>　　2.材料與方法 …………………

4、…………………………………………………4</p><p>　　2.1實驗材料 …………………………………………………………… 4</p><p>　　2.2實驗方法 ……………………………………………………………………5</p><p>　　3.結(jié)果與分析 …………………………………………………………………… 5</p><p>　

5、　3.1最小抑菌濃度測定結(jié)果………………………………………………………6</p><p>　　3.2最小殺菌濃度測定結(jié)果………………………………………………………6</p><p>　　4.討論 ……………………………………………………………………………… 6</p><p>　　4.1實驗中草藥藥性分析…………………………………………………………7</p&g

6、t;<p>　　4.2最小抑菌濃度和殺菌濃度的對比分析………………………………………8</p><p>　　致謝 ……………………………………………………………………………8</p><p>　　參考文獻 …………………………………………………………………………… 9</p><p>　　常見中草藥對鱉源嗜水氣單胞菌的體外抑制效應(yīng)</p

7、><p>　　[摘要] 以“廉價、易得、廣譜”為篩選原則，選取其中對革蘭氏陰性桿菌具殺滅效果的魚腥草、黃連、黃芩、金銀花、連翹、穿心蓮、大青葉、蒲公英、板藍根等9種常見廉價中草藥的10倍水提粉劑（按中草藥原料重量的10倍濃縮，即10克中草藥濃縮成1克的水提粉劑）作為實驗藥物。通過對最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測定，從中篩選出效果比較好的中草藥。結(jié)果：黃芩、金銀花、蒲公英對嗜水氣單胞菌抑菌作用較明顯,其MIC≤12.5

8、0mg/mL,其次是穿心蓮、黃連,其MIC均為12.50mg/mL, 魚腥草、連翹、大青葉、板藍根等其他4味藥的MIC均≥12.50 mg/mL。得到9種中草藥的抑菌效果從高到低依次為黃芩、金銀花、蒲公英、連翹、穿心蓮、黃連、魚腥草、板藍根和大青葉。殺菌效果和抑菌效果相似。</p><p>　　[關(guān)鍵詞] 中草藥 嗜水氣單胞菌 最小抑菌濃度 最小殺菌濃度</p><p>

9、　　Common herbal source of turtle Aeromonas hydrophila in vitro inhibitory effect</p><p>　　[Abstract] To "cheap, easy to get, broad-spectrum"for the screening principles, select one of the killing e

10、ffect of gram-negative bacilli with Heartleaf Houttuymia Herb, Coptis Root, Baical Skullcap Root, Honeysuckle Flower, Forsythia, Common Andrographis Herb, Indigowoad Leaf, Mongolian Dandelion Herb, Indigowoad Root,Cheap

11、common herbs such as 9 to 10 times the water extract powder (herbal raw materials by 10 times the weight of concentrated herbal concentrate that is 10 grams to 1 gram of wat</p><p>　　[Keywords] Chinese Herba

12、l Medicine Aeromonas hydrophila Minimum inhibitory concentration Minimum bactericidal concentration</p><p>　　常見中草藥對鱉源嗜水氣單胞菌的體外抑制效應(yīng)</p><p><b>　　1. 前言</b></p><p>

13、　　中華鱉（Trionyx sinensis）俗稱鱉、甲魚、團魚等，隸屬于爬行綱、龜鱉目、鱉科、鱉屬，具很高的營養(yǎng)、經(jīng)濟和藥用價值，深受廣大消費者青睞，是當前我國最重要的淡水養(yǎng)殖品種[1]。但目前中華鱉各種疾病的頻繁爆發(fā)已成為限制中華鱉養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要瓶頸之一。</p><p>　　嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila) ，隸屬于變形菌門（Proteobacteria）、丙型變形菌綱（Ga

14、mmaproteobacteria）、氣單胞菌目（Aeromonadales）、氣單胞菌科（Aeromonadaceae）、氣單胞菌屬（Aeromonas），是自然界中具復(fù)雜血清型和易于變異的常見菌，廣泛存在于淡水、土壤、污水、淤泥和人的糞便中，有致病性和非致病性菌株之分。其中致病性嗜水氣單胞菌是引起養(yǎng)殖動物暴發(fā)性死亡的最主要病原，同時也是淡水養(yǎng)殖動物細菌性疾病中經(jīng)濟損失最為嚴重的致病菌之一。大量研究表明，該菌對淡水魚感染率高達90%以

15、上，死亡率高達65%以上。以中華鱉為例，在目前已報道的25種中華鱉疾病中，由其引起的鱉病就達15種之多，僅中國淡水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)每年由致病性嗜水氣單胞菌病造成的經(jīng)濟損失就高達數(shù)百億人民幣元之巨。其中鱉紅脖子病是由嗜水氣單胞菌嗜水氣亞種( Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila) 引起的一種急性傳染病, 其死亡率高達60% , 是成鱉養(yǎng)殖期間最嚴重的一種疾病[16] 。黑斑病是最近幾年在稚鱉養(yǎng)殖過程中<

16、;/p><p>　　中草藥（Chinese Traditonal drug），中藥主要有植物藥、動物藥和礦物藥等。我國是中草藥的發(fā)源地，應(yīng)用中草藥歷史悠久，目前大約有12000種藥用植物，古代先賢對中草藥和中醫(yī)學(xué)的深入探究和總結(jié)更是我們的寶貴財富。很多中草藥的療效不但經(jīng)過了長期實踐的驗證，而且也已被現(xiàn)代科學(xué)研究所證實。有些中草藥的有效成分和分子結(jié)構(gòu)等也已經(jīng)被研究清楚。例如任玲玲[21]等人通過HPLC分析的方法確定了

17、黃芩乙酸乙酯部位的主成分為黃芩素和漢黃芩素,正丁醇部位的主成分為黃芩苷和黃芩素,水部位主要是黃芩苷。路保通[22]等人通過對蒲公英有效成分的提取及其抑菌活性作用實驗證明蒲公英的主要活性成分是黃酮類、有機酸和甾醇類物質(zhì)等,初步鑒定有機酸為綠原酸。蒲公英中的黃酮含量高、提取方法簡便易操作、且抗氧化能力較好，有很好的市場發(fā)展前景。綠原酸具有廣譜抗菌和利膽的作用,是蒲公英抗菌的主要有效成分。經(jīng)過長久的歷史考驗，古代先賢和廣大勞動人民長期積累的寶

18、貴經(jīng)驗是遺留給我們的巨大財富，我們應(yīng)該好好的借鑒古人的勞動成果和寶貴經(jīng)驗，并不斷摸索和改進。中草藥在很多魚病的防治中已經(jīng)得到了很好的驗證，其中大蒜有效成分為大蒜</p><p>　　目前有關(guān)水產(chǎn)動物疾病的防控和治療，主要有使用化學(xué)消毒劑、抗生素、使用免疫增強劑、使用疫苗，前二種已有30余年的歷史，因長期使用，已產(chǎn)生抗藥性并影響產(chǎn)品質(zhì)量，并嚴重威脅著人類的健康；第三種中化學(xué)增強劑有毒副作用大、局部刺激強、致癌、制備

19、和使用麻煩或不能足夠提高弱抗原的免疫原性等弊端；生態(tài)防病制劑則菌體穩(wěn)定性差、活性難維持、必須在消化道中達到一定數(shù)量、對突發(fā)病作用甚微的弊端；最后一種則對于血清型復(fù)雜且易于發(fā)生變異的致病性嗜水氣單胞菌而言往往效果不佳，極易免疫失敗。尤其是Rijker等發(fā)現(xiàn)，使用土霉素能夠抑制哺乳動物的體液免疫，口服抗生素在對致病菌產(chǎn)生殺傷或抑制作用的同時也會影響動物體內(nèi)正常微生物的種群，甚至破壞體內(nèi)的微生態(tài)平衡，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和人類的生活造成了很大的

20、影響。在提倡健康綠色生活的今天，提高初級水產(chǎn)品質(zhì)量，減少微生物和化學(xué)因素危害已成為世界關(guān)注的焦點。有效抑制養(yǎng)殖水域環(huán)境中致病性嗜水氣單胞菌的數(shù)量密度，切實保障養(yǎng)殖生物正常生長與繁衍，保證養(yǎng)殖水產(chǎn)品質(zhì)量安全，已成為關(guān)乎水產(chǎn)養(yǎng)殖健康發(fā)展的重要命題之一。</p><p>　　目前，中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用仍存在很大的局限性。對于應(yīng)用在養(yǎng)殖上的單位和復(fù)方中草藥大多是借鑒人用或者獸用的配方，中草藥對于防治細菌性疾病的研究仍

21、是很不完善雖然做了很多相關(guān)實驗，但大部分仍停留在定性方面。針對上述缺陷，本文所要研究的技術(shù)問題是通過對最小抑菌和殺菌濃度的測定篩選出效果比較好的中草藥，為復(fù)方中草藥提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，進而提供一種用于防控水生動物嗜水氣單胞菌病的中藥及其使用方法。</p><p><b>　　2. 材料與方法</b></p><p><b>　　2.1實驗材料</b>&

22、lt;/p><p><b>　　2.1.1實驗菌 </b></p><p>　　以鱉源強致病性嗜水氣單胞菌ZHYYZ-1（GENBANK登錄號：GU563992）為實驗菌，由水產(chǎn)養(yǎng)殖實驗室安全養(yǎng)殖分室提供，為致病性強毒株。</p><p>　　2.1.2中草藥和培養(yǎng)基 </p><p>　　中草藥魚腥草、黃連、黃芩、金銀花、

23、連翹、穿心蓮、大青葉、蒲公英、板藍根等均購自舟山同仁堂。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(含2％NaC1)、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(含2％NaC1)均選購自杭州微生物試劑有限公司。</p><p>　　2.1.3實驗儀器 </p><p>　　生化培養(yǎng)箱（型號SHP-750）、雙人單面凈化工作臺（型號SW-CJ-2FD）、立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器（型號LDZX-40SAI）、培養(yǎng)皿、涂布棒、玻璃棒、燒杯、錐形瓶等

24、</p><p><b>　　2.2實驗方法</b></p><p>　　2.2.1中草藥的篩選和制備 </p><p>　　查閱相關(guān)文獻資料，以“廉價、易得、廣譜”為篩選原則，選取其中對革蘭氏陰性桿菌具殺滅效果的魚腥草、黃連、黃芩、金銀花、連翹、穿心蓮、大青葉、蒲公英、板藍根等9種常見廉價中草藥的10倍水提粉劑（按中草藥原料重量的10倍濃縮，

25、即10克中草藥濃縮成1克的水提粉劑）作為實驗藥物，粉劑粒徑大小可過80目篩網(wǎng)。</p><p>　　2.2.2菌懸液的制備 </p><p>　　實驗菌經(jīng)30℃斜面培養(yǎng)18h后，用無菌生理鹽水洗下菌苔，依次制成菌濃度為1.0×104cfu/ml、1.0×105cfu/ml、1.0×106cfu/ml 、1.0×107 cfu/ml的懸液， 4℃保存?zhèn)?/p>

26、用。</p><p>　　2.2.3含藥平板的制備 </p><p>　　各實驗藥物分別用蒸餾水加熱溶解，并制成一定濃度的母液；采用2倍稀釋法，用蒸餾水梯次稀釋母液至藥物最小抑菌濃度（菌懸液濃度為1.0×104cfu/ml）的一半；設(shè)置若干藥液體積梯度，依次加入營養(yǎng)瓊脂并加熱溶解，121℃高壓滅菌20min，無菌操作，制成不同濃度的含藥平板，30℃過夜培養(yǎng)。</p>

27、<p>　　2.2.4最小抑菌濃度的測定</p><p>　　將制備好的菌懸液依次均勻涂布于各含藥平板（100µl菌液/塊），每個濃度梯度設(shè)3個對照組，30℃恒溫培養(yǎng)24h后測定各實驗藥物對不同濃度菌液的最小抑菌濃度（以含藥平板上殘留菌落數(shù)小于10個菌落的藥物濃度作為該藥物的最小抑菌濃度，MIC）。</p><p>　　2.2.5最小殺菌濃度的測定</p>

28、<p>　　將制備好的菌懸液依次均勻涂布于各含藥平板（100µl菌液/塊），每個濃度梯度設(shè)3個對照組，30℃恒溫培養(yǎng)48h后測定各實驗藥物對不同濃度菌液的最小殺菌濃度（以實驗菌殺滅率達到90%的藥物濃度為最小殺菌濃度，MBC）。</p><p><b>　　3. 結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1最小抑菌濃度的測定結(jié)果</p&

29、gt;<p>　　從表1可見，9種中草藥對嗜水氣單胞菌的抑菌效果均不同。根據(jù)對各組數(shù)據(jù)的比較和判定，9種中草藥的抑菌效果從高到低依次為黃芩、金銀花、蒲公英、連翹、穿心蓮、黃連、魚腥草、板藍根和大青葉。其中黃芩、蒲公英、金銀花對嗜水氣單胞菌抑菌作用較明顯,其MIC≤12.50mg/mL,其次是穿心蓮、黃連,其MIC均為12.50mg/mL, 魚腥草、連翹、大青葉、板藍根等其他4味藥的MIC均≥12.50 mg/mL。<

30、/p><p>　　表1 各實驗藥物對實驗菌不同菌液濃度的最小抑菌濃度（mg/ml）</p><p>　　Table 1 Experimental strains of experimental drugs on different bacterial concentration minimum inhibitory concentration (mg / ml)</p>&l

31、t;p>　　3.2最小殺菌濃度的的測定結(jié)果</p><p>　　從表2可見，9種中草藥對嗜水氣單胞菌都有殺菌效果。根據(jù)對各組數(shù)據(jù)的比較和判定，9種中草藥的殺菌效果從高到低依次為黃芩、金銀花、蒲公英、連翹、穿心蓮、黃連、魚腥草、板藍根和大青葉。其中殺菌作用以黃芩、蒲公英、金銀花為最強,其MBC≤3.12 mg/mL,魚腥草、黃連、連翹、穿心蓮MBC均為12.50 mg/mL,其余2味藥大青葉和板藍根的MBC均

32、在12.50-25.00mg/mL間。</p><p>　　表2 各實驗藥物對實驗菌不同濃度菌液的最小殺菌濃度（mg/ml）</p><p>　　Table 2 Experimental strains of experimental drugs on the concentration of bacilli with different minimum bactericidal con

33、centration (mg / ml)</p><p>　　從表1，表2可知，抑菌和殺菌作用都以黃芩、蒲公英、金銀花為最強，其次連翹、穿心蓮、黃連、魚腥草、板藍根和大青葉，抑菌和殺菌濃度的數(shù)據(jù)基本上沒有變化。其中黃芩的主要有效成分了黃酮類化合物，黃芩苷, 黃芩素, 漢黃芩苷等,蒲公英的主要活性成分是黃酮類、有機酸和甾醇類物質(zhì)等，而金銀花中黃酮類的含量也是相當?shù)母?，連翹中也含有黃酮類化合物，但含量較少。初步判定，

34、黃酮類化合物對于嗜水氣單胞菌的抑制效果俱佳。</p><p><b>　　4. 討論</b></p><p>　　4.1實驗中草藥藥性分析</p><p>　　目前有關(guān)水產(chǎn)動物疾病的防控和治療，主要有使用化學(xué)消毒劑和抗生素，這類藥物的抗菌活性比較高。馬力[23]等試驗結(jié)果表明,鹽酸環(huán)丙沙星、乳酸環(huán)丙沙星、恩諾沙星、單諾沙星、二氟沙星對嗜水氣單胞

35、菌的MIC分別為0.00625、0.00625、0.10125、0.05、0.20μg/mL,MBC分別為0.025、0.025、0.05、0.10、0.80μg/mL。但是長期使用抗生素藥物，會造成在魚體內(nèi)的大量殘留，同時引起魚體的藥物的抗耐性。在實驗中我們可以看出，相對于抗生素，中草藥的抗菌活性要低。但是在魚體免疫和安全無毒方面，以及對魚體的誘食方面是抗生素?zé)o法比擬的。且中草藥分布廣泛，價格低廉，在全國各地的應(yīng)用及其廣泛，且安全無毒

36、，副作用小，藥物殘留少等特點是抗生素?zé)o法比擬的，廣泛且深入的開展對中草藥抗菌研究意義非凡。</p><p>　　對于中草藥的藥性，前人做了大量的研究。其中黃芩味苦性寒，歸心、肝、膽、大腸經(jīng)，含多種黃酮類化合物, 主要為黃芩苷, 黃芩素, 漢黃芩苷, 漢黃芩素, 7-甲氧基黃芩素, 7-甲氧基去甲基漢黃芩素,黃芩黃酮Ⅰ，黃芩黃酮II等[21]。它的抗菌較為廣譜，對多種細菌，包括金黃色葡萄球菌，痢疾桿菌，霍亂弧菌，大

37、腸桿菌，綠膿桿菌均有抑制作用?？梢杂糜诜乐嗡a(chǎn)養(yǎng)殖中一系列疾病，包括出血病，爛鰓病和腸炎等。</p><p>　　金銀花味甘性寒，歸肺、胃經(jīng)，主要成分為綠原酸類、苷類、黃酮類、揮發(fā)油類等，主要抗菌成分為黃酮類和綠原酸類[19]。對多種水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見病菌有較好的抑制效果，包括金黃色葡萄球菌，痢疾桿菌等，對嗜水氣單胞菌也有較好的抑制</p><p>　　蒲公英味甘、微苦，性寒，歸肝、胃經(jīng)，主要

38、活性成分為黃酮類、有機酸和甾醇類物質(zhì)等[21]。主要功效是清熱解毒,利濕,利尿通淋，消腫散結(jié)等,對于金黃色葡萄球菌，綠膿桿菌，等有害細菌都有較好的抑制效應(yīng)。在水產(chǎn)上常用于防治出血病，腸炎病和爛鰓等。</p><p>　　板藍根味苦性寒，歸肝、胃經(jīng)，含靛藍，靛玉紅，谷甾醇類以及多種氨基酸，具有清熱解毒，消炎利喉等功效。對金黃色葡萄球菌，痢疾桿菌，溶血性鏈球菌，綠膿桿菌等病原菌有較強的抑制作用。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，只要用于

39、魚類出血性敗血病，爛鰓病和腸炎病等。</p><p>　　連翹味微苦性寒，歸肺、心、膽經(jīng)，主要成分為連翹酚，揮發(fā)油，以及少量黃酮類等。對金黃色葡萄球菌具有很好的抑制作用，對大腸桿菌，痢疾桿菌，霍亂弧菌，白喉桿菌和鏈球菌均有較好的抑制效果，也是水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中常用的水產(chǎn)藥物，對于出血病等都有一定的治療效果。</p><p>　　魚腥草味辛性寒，歸肝、肺經(jīng)，地上部分含揮發(fā)油、內(nèi)含抗菌有效成分癸酰

40、，亦是常用殺菌抗菌藥物。具有消炎殺菌，利尿止痛等功效。對于很多微生物細菌都有抑制作用，其中對于卡他球菌，痢疾桿菌，大腸桿菌，金黃色葡萄球菌等都有較好的抑制效果，對于酵母菌和霉菌的抑制效果最佳。</p><p>　　大青葉味苦性寒，歸肝、心、胃、脾經(jīng)，主要化學(xué)成分是靛苷，靛玉紅，具有止血，清熱解毒，可用于治療急性腸炎，流行性感冒等。對于多種痢疾桿菌有較好的殺滅作用，對于金黃色葡萄球菌等亦有較好的抑制作用。在水產(chǎn)養(yǎng)殖

41、過程中，常常用于魚類出血病的治療和防護。</p><p>　　從上述幾種中草藥的主要成分可以看出，9種中草藥對嗜水氣單胞菌都有一定的抑制作用。從藥性上來看，黃芩，金銀花，蒲公英這3種藥的有效成分中都含有黃酮類化合物，且含量比較高。連翹中雖然也含有黃酮類化合物，但含量相對較少，抑菌效果略差。至于大青葉和板藍根的有效成分，其中有相似部分，均含靛苷，靛玉紅，其抑菌和殺菌效果也差別不大。據(jù)此，初步判定黃酮類化合物對嗜水氣

42、單胞菌的抑制和殺滅效果比較好，具體作用機理有待進一步考證。</p><p>　　4.2最小抑菌濃度和殺菌濃度的對比分析</p><p>　　前人對于中草藥的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度也進行了大量研究，如彭金菊[24]等通過實驗測得黃芩MIC為25 mg/mL,魚腥草，大青葉等MIC均≥100 mg/mL，MBC類似；楊向江[25]的中草藥對嗜水氣單胞菌的體外抑制效果實驗中得出黃芩的MIC≤

43、50 mg/mL，金銀花的50≤MIC≤100，MBC類似；汪黎虹，關(guān)瑞章[26]等人通過實驗測得黃芩的MIC為0.75 mg/mL，MBC為1.50 mg/mL，金銀花的MIC為16.0 mg/mL，MBC為32.0 mg/mL，黃連的MIC為128.0 mg/mL，MBC為128.0 mg/mL。喻運珍，艾桃山[27]等人對于嗜水氣單胞菌對4種中草藥和4種抗生素耐藥性的比較研究中測得，對于嗜水氣單胞菌SH-92-02和C-95050

44、1，大黃的MIC為16 mg/mL，穿心蓮的MIC為250 mg/mL。為此對比，本次實驗所得的數(shù)據(jù)效果明顯較優(yōu)，實驗結(jié)果存在明顯差異，可能與實驗手法，條件不一致有關(guān)，包括實驗菌株毒性強弱，藥物實驗部位（根，莖，葉，花，果實，種子等），以及藥物提取方法等。與彭金菊等使用傳統(tǒng)水煎法相比，本次實驗所采用的水提法</p><p>　　鑒于目前，對防治鱉源致病性嗜水氣單胞菌的最佳中草藥在中華鱉細菌性疾病中的開發(fā)應(yīng)用還處于

45、摸索階段。而且中草藥的組成成分復(fù)雜，其具體成分、作用方式和機理如何,仍有待于進一步研究。</p><p><b>　　[參 考 文 獻]</b></p><p>　　[1]鞠長增.鱉的養(yǎng)殖與疾病防治[M].鄭州: 河南科學(xué)技術(shù)出版社, 1997112521281</p><p>　　[2]程天印,王小君.水體嗜水氣單胞菌[J].信陽師范學(xué)院報(

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47、; 龔暉; 林天龍; 不同來源嗜水氣單胞菌的抗菌素耐藥性及耐藥機制分析[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報 2008年02期</p><p>　　[6] 宋鐵英，包曉東，鄭偉文 中華鱉爆發(fā)性傳染病研究 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 2002 （2）</p><p>　　[7] 趙春光. 中草藥防治龜鱉肝病[J]. 漁業(yè)致富指南, 2003, (12)</p><p>　　[8] 蔡東宏.

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