荷葉堿的制備及類似物的合成畢業(yè)論文

1、<p>　　荷葉堿的制備及類似物的合成</p><p>　　專業(yè)名稱：制藥工程 學(xué)號：00000 姓名：XXX</p><p>　　指導(dǎo)教師：XXX 職稱：副教授</p><p><b>　　中文摘要：</b></p><p>　　隨著我國人口老齡化的到來，老年癡呆

2、癥疾已成為繼癌癥、糖尿病、心腦血管病后的又一重大疾病。目前研究發(fā)現(xiàn)了一些具有乙酰膽堿酯酶抑制的活性成分，主要為生物堿、萜、黃酮和香豆索等結(jié)構(gòu)類型的化合物。其中生物堿類乙酰膽堿酯酶抑制劑如石杉堿甲、 加蘭他敏等因活性高、選擇性強而受到廣泛的關(guān)注。研究表明，在目前發(fā)現(xiàn)的天然乙酰膽堿酯酶抑制劑中，生物堿占絕大多數(shù)，約占60%以上，但這些成分應(yīng)用到臨床上還不多，主要是由于活性不是很強，選擇性不好的原因。因此，進一步開展對具有乙酰膽堿酯酶抑制活性

3、成分的篩選，尋找新的具有高抑制活性和選擇性的先導(dǎo)化合物對發(fā)現(xiàn)新的治療老年性癡呆癥具有重要意義。本實驗以具有較好乙酰膽堿酯酶抑制活性的荷葉堿初步改造物為先導(dǎo)物，通過乙酰膽堿酯酶與乙酰膽堿酯酶抑制劑的雙中心原理，對荷葉堿進行一系列的結(jié)果改造，以期獲得一種活性更強、專業(yè)性更好的體外乙酰膽堿酯酶抑制劑，進而為今后的臨床應(yīng)用提供條件。</p><p>　　關(guān)鍵詞：老年癡呆癥 乙酰膽堿酯酶抑制劑 荷葉堿 結(jié)構(gòu)改造<

4、;/p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　With the arrival of population aging, Alzheimer's disease has become the another major diseases after the cancer, diabetes, cardiovascular and ce

5、rebrovascular. Many acetylcholine- sterase inhibitory activity has been found,such as alkaloids, terpenoids, flavonoids and coumaric cable structure of the type of compounds .It has showed that in the current discovery o

6、f natural, about 60% or more acetylcholinestera1se in hibitors is alkaloid. But these haven’t be used in our life,because of the low a</p><p>　　Keywords: acetylcholinesterase inhibitors Alzheimer'sdisea

7、se nuciferine restructuring</p><p><b>　　目錄</b></p><p><b>　　中文摘要1</b></p><p>　　Abstract2</p><p><b>　　一、綜述4</b></p><p&

8、gt;　　(一)老年癡呆癥4</p><p>　?。ǘ┥飰A類乙酰膽堿酯酶抑制劑4</p><p>　?。ㄈ┖扇~堿及其系列改造7</p><p><b>　　二、材料與方法8</b></p><p>　?。ㄒ唬?、材料和儀器8</p><p>　　(二)、試驗方法8</p>

9、;<p>　　三、結(jié)果與分析12</p><p>　?。ㄒ唬?、生物堿提取結(jié)果12</p><p>　?。ǘ⒑扇~堿G-1制備結(jié)果12</p><p>　?。ㄈ?、荷葉堿G-2制備結(jié)果12</p><p><b>　　四、討論13</b></p><p><b>

10、　　五、結(jié)論13</b></p><p><b>　　參考文獻13</b></p><p><b>　　一、綜述</b></p><p><b>　　(一)老年癡呆癥</b></p><p>　　老年癡呆癥亦稱阿爾茨海默病(Alzheimer,s Diseas

11、e)簡稱 AD。 1907年由德國病理學(xué)家阿爾茨海默發(fā)現(xiàn)。指的是一種持續(xù)性高級神經(jīng)功能活動障礙，即在沒有意識障礙的狀態(tài)下，記憶、思維、 分析判斷、視空間辨認 、辨認等方面的障礙，常發(fā)生于 50歲以上的老年人 。 </p><p>　　隨著我國經(jīng)濟的飛速發(fā)展和廣大人民生活水平的日益提高，人均壽命也隨之延長，使我國60歲以上老年人日益增多，預(yù)計我國2015年老年人口將超過2億，本世紀40年代后期可能突破4億。老年癡

12、呆的發(fā)病率隨著人口老齡化的進展呈逐年上升的趨勢。目前全世界患病人數(shù)已超過1800萬，我國患病人數(shù)約有500萬，是世界上患病人數(shù)最多的國家。據(jù)報道，目前我國60歲以上每20人中有1人，80歲時每6人中有1人，90歲時每3人中有1人患此癥， 已成為繼心 腦血管疾病后，威脅我國老年人健康的主要疾病。在美國，AD繼心、 腦血管疾病，癌癥之后，成為成人死因的第四位。預(yù)計在今后20年內(nèi)其患病的人數(shù)將增長3倍，由于AD的病因、發(fā)病機制還不十分清楚，不

13、能早期診斷，更無有效的治療措施，因此加速對AD致病機理的研究和尋找有效的AD治療藥物有著重要的醫(yī)學(xué)和社會意義，已經(jīng)成為國際醫(yī)藥界矚目的熱點和前沿領(lǐng)域。AD的生化機理和發(fā)病機制的研究普遍認為，AD患者腦內(nèi)膽堿能功能的減退是認知障礙和記憶能力缺損的直接原因，13．淀粉樣蛋白(13．a(chǎn)myloidpeptide，A B)是引起患者病理學(xué)特征的根本原因，A 13的聚集沉積誘發(fā)一系列的生</p><p>　?。ǘ┥飰A類

14、乙酰膽堿酯酶抑制劑</p><p>　　目前臨床使用的AD治療藥物主要是乙酰膽堿酯(Acetylcholinesterase，AChE)抑制劑，該類藥物能夠選擇性抑制腦內(nèi)AChE的活性，延長ACh在大腦內(nèi)的存留時間，提高AD病人的膽堿神經(jīng)功能和認知能力。美國食品和藥品管理局(FDA)批準上市的五個AD治療藥物中有四個為AChE抑制劑，包括他克林(tacrine)、多奈哌齊(donepezil)、利斯的明(riva

15、stigmine)和加蘭他敏(galanthamine，GNT)。但是，已有的AChE抑制劑通常只能減輕癥狀而不能從根本上治愈AD，而且存在肝中毒、半衰期短、中樞選擇性差等缺點而在臨床應(yīng)用上受到限制。因而，世界各地對新型、低毒、高效的膽堿酯酶抑制劑的研究日趨激烈，特別是從天然動植物中尋找并發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿酯酶抑制劑或著是根據(jù)構(gòu)效關(guān)系推測其有可能成為膽堿酯酶抑制劑前體物質(zhì)，以期獲得新型膽堿酯酶抑制劑的的思路和方法成為了共同的做法。研究表明，生

16、物堿類乙酰膽堿酯酶抑制劑因活性高、選擇性強而受到廣泛的關(guān)注，在目前發(fā)現(xiàn)的天然乙酰膽堿酯酶抑制劑中，生物堿占絕大多數(shù)，約占60%以上。因此進一步開展對天然生物堿的研究具有極其重要的意義。</p><p><b>　　1.石杉堿甲 </b></p><p>　　石杉堿甲(HuperzineA，圖1)是從石杉屬植物千層塔( 蛇足石杉，Hu perzia serrata)中分

17、離得到的一種新型生物堿有效單體【2】。與其它目前開發(fā)用于治療AD的藥物相比，石杉堿甲對腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶具有極高的選擇性、抑制性和可逆性抑制， 提高腦內(nèi)AChE水平作用持續(xù)達6h，優(yōu)于加蘭他敏,多奈哌齊和他克林【3】。該品口服可改善AD患者的記憶和認知行為障礙，無嚴重不良反應(yīng)，已由中國科學(xué)院上海藥物所研制開發(fā)為一種可逆性治療AD藥物【4】。但石杉堿甲在植物中的含量很低， 其復(fù)雜結(jié)構(gòu)又使人工合成成本遠遠高于植物提取，使得在保留活性基礎(chǔ)上的結(jié)

18、構(gòu)簡化工作顯得非常迫切。為闡明石杉堿甲抗乙酰膽堿酯酶活性的構(gòu)效關(guān)系和尋找更有效的治療早老性癡呆的藥物，合成了大量石杉堿甲的衍生物和類似物。起初對石杉堿甲的結(jié)構(gòu)改造在它易于修飾的部位,用苯環(huán)、嘧啶酮環(huán)、苯酚、鄰苯二酚等相似結(jié)構(gòu)替代石杉堿甲的吡啶酮環(huán)(A環(huán))，生物活性大大降低。而三碳橋環(huán)及其雙鍵、 橋頭的甲基和環(huán)外雙鍵對于其抗膽堿酯酶的活性是必須的，如失去或被其他基團替代，活性就大大降低。在石杉堿甲的氨基位置引入胺甲基、羥甲基或疊氮等取代基

19、，活性也</p><p>　　石杉堿甲的特殊結(jié)構(gòu),使保留其整體骨架的類似物合成在難度上不亞于石杉堿甲的全合成?？茖W(xué)家們期待能應(yīng)用一些結(jié)構(gòu)簡化的片段代替石杉堿甲,然而已合成的可能的單環(huán)或雙環(huán)結(jié)構(gòu)幾乎沒有活性， 人們開始轉(zhuǎn)向用石杉堿甲的結(jié)構(gòu)判斷與現(xiàn)有的結(jié)構(gòu)最簡單的乙酰膽堿酯酶抑制劑 tacrine結(jié)合。一個烷烴( n=7 )連接的雙分子tacrine(BIS—Tacrine)和石杉堿甲的橋頭環(huán)結(jié)合tacrine的化合

20、物huperineX和Y顯示，有比石杉堿甲和 tacrine更好的乙酰膽堿酯酶抑制活性。一系列tacrine與石杉堿甲的( A+B ) 環(huán)用烷鏈相連接的 </p><p>　　化合物也顯示了較好的活性，其中化合物 B( n=1O )的活性是石杉堿甲的13倍,tacrine的25倍，不過選擇性遠遠低于石杉堿甲【5】。 </p><p>　　圖1 石杉堿甲及其類似物的結(jié)構(gòu)</p>

21、<p><b>　　2. 加蘭他敏 </b></p><p>　　加蘭他敏(Galanthamine,圖2)是從石蒜科植物中分離得到的一種生物堿,主要來源于黃花石蒜(Lycoris aurea)、石蒜(L.radiata)及白水仙(Narcissus papyraceus )鱗莖、夏雪片蓮(Leucojumaestivum) 、雪片蓮(L.vernum)、沃氏雪花蓮(Galant

22、hus woronawii)的葉、球莖、克氏雪花蓮 (G.krasnovii)、雪花蓮(G.nivalis )的全草、斯特倫伯石蒜(Sternbergia sicula)球莖和波斯石蒜(Ungernia spiralis)葉等【6】。加蘭他敏是一種可逆性乙酰膽堿酯酶抑制劑，能刺激煙堿受體【7，8】，提高膽堿功能和記憶,其療效與他克林相似,稍弱于毒扁豆堿,有效時間長,半衰期5～6h,不良反應(yīng)少,且無肝毒性【9】。薛壽儒等報道，分別應(yīng)用加蘭

23、他敏膠囊和吡拉西坦膠囊治療37例老年癡呆和單純性記憶障礙，加蘭他敏組總有效率達70％，而吡拉西坦膠囊組總有效率僅達40%【10】。</p><p>　　圖2 加蘭他敏的結(jié)構(gòu)</p><p><b>　　3. 毒扁豆堿 </b></p><p>　　毒扁豆堿(Physostigmine，圖3)為豆科植物毒扁豆(Physostigma vene

24、nosum)種子的主要生物堿，是一種非選擇性可逆性乙酰膽堿酯酶抑制劑,它能抑制G1和G4AChE的形成【11】，提高大鼠記憶和改善東莨菪堿所致學(xué)習(xí)記憶障礙【12】,易于吸收和透過血腦屏障,毒性大,半衰期較短,t1/2為30min,治療窗較窄【13】。 </p><p>　　酒石酸庚基毒扁豆堿(Eptastigmine)為毒扁豆堿的親脂性衍生物， 能適度抑制血漿及紅細胞內(nèi)的乙酰膽堿酯酶活性。療效強于毒扁豆堿,酶抑

25、制時間可達24h,毒性僅為毒扁豆堿的1／60【14】。</p><p><b>　　圖3</b></p><p><b>　　4.其他生物堿 </b></p><p>　　小檗堿(Berberine)、巴馬亭(Palmatine)和去氫吳茱萸堿(Dehydroevodiamine)能改善東莨菪堿所致大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙【15，

26、16】。石蒜科文殊蘭屬植物C.jagus和C.glaucum在尼日利亞作為治療老年性癡呆的傳統(tǒng)用藥,從中分離得到的網(wǎng)球花堿(Haemanthamine )、Hamayne 、Crinamine和石蒜堿(Lycorine)能提高腦內(nèi)乙酰堿膽堿含量【17】。黨參總堿有改善東莨菪堿所致學(xué)習(xí)記憶障礙和促進膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶生成乙酰膽堿的作用【18】。</p><p>　　但是，這些成分應(yīng)用到臨床上還不多，主要是由于活性不是

27、很強，選擇性不好的原因，還有待繼續(xù)篩選。因此，本次實驗就著重開展荷葉堿及其結(jié)構(gòu)改造物對乙酰膽堿酯酶的體外高活性抑制能力的研究。</p><p>　?。ㄈ┖扇~堿及其系列改造</p><p>　　在本實驗前期的研究工作中表明，荷葉中存在大量生物堿，其乙酰膽堿酯酶抑制活性研究顯示荷葉堿膽堿酯酶抑制活性一般，但荷葉堿初步改造物具有較好的乙酰膽堿酯酶抑制力。根據(jù)構(gòu)效關(guān)系的研究，推測若對荷葉堿加以改

28、造，其乙酰膽堿酯酶抑制活性會得到較大的提高，因此本實驗設(shè)計對其進行結(jié)構(gòu)改造，以獲得活性更高專一性更強的新型藥物</p><p><b>　　1.荷葉堿</b></p><p>　　荷葉堿為荷葉中的主生物堿，約占荷葉總堿的50%以上。荷葉堿由四個相連的六元環(huán)組成，其中環(huán)1、2位為甲氧基，7位為氮甲基，根據(jù)乙酰膽堿酯酶抑制劑的雙中心原理推測，若將1、2為的甲氧基消解羥基，

29、則其乙酰膽堿的專一性結(jié)合能力將會的到加強，并且其極性將得到一定的增大。根據(jù)結(jié)構(gòu)類似物的許多乙酰膽堿酯酶抑制劑結(jié)構(gòu)研究，7位的與氮相連的集團的大小、極性等對乙酰膽堿酯酶抑制劑的活性有直接的影響。</p><p><b>　　2.荷葉堿G-1</b></p><p>　　使用無水DMF為溶劑，二芐基二硒、硼氫化鈉對荷葉堿進行一位甲氧基消解，以獲得荷葉堿G-1。已實驗獲得該

30、化合物具有較好的乙酰膽堿酯酶抑制活性。

31、 </p><p><b>　　3.荷葉堿G-2</b></p><p>　　使用乙

32、氰、三溴化鋁對荷葉堿G-1進行進一步改造，將其2位甲氧基消解為羥基，的荷葉堿G-2。</p><p><b>　　二、材料與方法</b></p><p><b>　?。ㄒ唬?、材料和儀器</b></p><p><b>　　1、藥材</b></p><p>　　荷葉（購自蘭州安寧

33、醫(yī)藥公司復(fù)興厚藥莊，由蘭州理工大學(xué)楊林副教授鑒定。）</p><p><b>　　2、試劑</b></p><p>　　工業(yè)乙醇 氯仿（分析純） 濃鹽酸（分析純） 濃氨水（分析純） 氫氧化鈉（分析純） 濃鹽酸（分析純）濃硫酸 硼氫化鈉 乙氰(分析純) 二芐基二硒 三溴化鋁 柱層析硅膠 GF-254薄層硅膠 </p><p><b&

34、gt;　　3、儀器</b></p><p>　　HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司） ZF-7型三用紫外分析儀（上海金達生化儀器有限公司） RE-5286A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠) SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵（保定高薪區(qū)陽光科教儀器廠） KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（40KHz，80W，）DL-3005低溫循環(huán)水?。ńK金壇市醫(yī)療器械廠） 冰箱 移液

35、槍（200L，1000L） 分析天平 容量瓶 冷凝管 燒杯（500mL）玻璃棒 玻璃柱 圓底燒瓶（1000 mL，500mL，100,5L）三口圓底燒瓶（100ml，50ml）分液漏斗（3000 mL，100ml）布氏漏斗 抽慮瓶 電吹風(fēng)</p><p><b>　　(二)、試驗方法</b></p><p><b>　　1、生物堿提取過程</b>

36、</p><p><b>　　(1) 藥材預(yù)處理</b></p><p>　　將藥材用粉碎機粉碎（在粉碎藥材前要將粉碎機清理干凈，避免上種藥材混入，造成實驗誤差）</p><p><b>　?。?）生物堿提取</b></p><p>　　稱取荷葉粉沫500g加入到5L的大圓底燒瓶中，按照質(zhì)體比1:7

37、加入3500ml工業(yè)乙醇，85℃水浴加熱回流兩次，每次2h，抽濾并合并回流液。將抽濾液分批加入1000ml圓底燒瓶減壓蒸餾，濃縮至粘稠浸膏。在浸膏中加入約600ml水溶解，使用2mol/L的HCL將PH調(diào)至2-3，充分攪拌并靜止過夜。對過夜后的溶解液進行抽濾，濾液使用2mol/L NaOH將PH調(diào)至10-11，將溶液轉(zhuǎn)入分液漏斗中使用氯仿萃取4次，每次氯仿700ml，減壓蒸餾氯仿。既得荷葉總堿。</p><p>

38、　　實驗現(xiàn)象：所得荷葉醇提物為深深的磚紅色，經(jīng)濃縮后獲得大量黑色浸膏，此浸膏在加入水后并不溶解，此時水中顯淡淡的磚紅色，在調(diào)PH至2-3后，水的顏色有加深，考慮到浸膏太過粘稠并不溶于水，所以使用玻璃棒對其進行了充分的攪拌，此時水溶液的顏色已變?yōu)檩^深的磚紅色。在抽濾后的酸性溶液中加入NaOH調(diào)堿時，在PH調(diào)至5-6時溶液開始出現(xiàn)大量磚紅色絮狀沉淀，繼續(xù)加NaOH后絮狀沉淀繼續(xù)增加，在PH調(diào)至9后，絮狀沉淀的增加減少。在萃取時，氯仿溶液顯淺

39、綠紅色。</p><p>　　2.荷葉總堿的細分離</p><p>　　2.1荷葉總堿的粗分離</p><p>　?。?）樣品的預(yù)處理及裝柱</p><p>　　根據(jù)資料得知荷葉總堿有四種主要成分，其中荷葉堿含量最高，既為薄層板上的最主點。將所得的荷葉堿點準備上樣與薄層硅膠色譜柱上進行分離，點總樣于4*8的小型號GF254薄層板硅膠板上，使用

40、氯甲比為1:1混合液為展開劑，展開，所點樣品主點Rf值大于0.5,并且樣品混合未得到分離。重新點樣，使用氯甲比為10:1混合液展開，所點樣品主點分離任然較模糊，使用氯甲比為35:1混合液展開，展開結(jié)果顯示較好。荷葉堿的展開主點Rf值約為0.3由此確定使用氯甲比為35:1的混合液為洗脫劑。</p><p>　　將所得的荷葉總堿稱取2.8g（2.823g），使用少許氯仿溶解（約3ml）轉(zhuǎn)移至小型蒸發(fā)皿，稱取1.5g硅

41、膠，將硅膠加入蒸發(fā)皿中的氯仿溶解液中，適當(dāng)攪拌溶液，將蒸發(fā)皿靜止與通風(fēng)廚下，待其揮干。稱取薄層色譜柱硅膠70g，置于 250ml燒杯中，使用氯甲比為40:1的洗脫液溶解并攪拌至懸濁液，玻璃棒引流裝入中型玻璃柱中，靜止待其沉降，打開玻璃柱活塞，適量的放出少許溶劑至溶液上端略高于硅膠層2cm時關(guān)閉活塞。將蒸發(fā)皿中已揮干了溶劑的的硅膠使用研磨棒研細，并使用漏斗加入玻璃柱中，盡量保持硅膠曾的平整，使用少許洗脫劑沖洗漏斗及玻璃柱壁中所粘的硅膠粉末

42、。再稱取1.5g柱層析硅膠將其再加入柱中作為最上層的覆蓋。</p><p><b>　?。?）樣品的洗脫</b></p><p>　　加入足量洗脫劑于柱中（剛開始需用吸管緩加，以免將硅膠被沖起），使用100ml錐形瓶接收洗脫液，開始沖柱，每次洗脫液接受至70ml左右換接受瓶，并將所接受的洗脫液移入200ml圓底燒瓶中進行減壓蒸干，再使用少許氯仿（約1ml）溶解并移入小

43、青霉素瓶中，再次使用少許氯仿（約1ml）沖洗燒瓶兩次，將沖洗液移入同一個青霉素瓶中，并對所對應(yīng)的青霉素瓶進行標簽編號(共約45瓶，在沖至三十瓶左右時所得沖洗液中所含有效成份太少，所以改用氯甲比為30:1洗脫液沖洗)。</p><p>　?。?）樣品的點樣粗分離</p><p>　　對上步所得的青霉素瓶中的溶液從第一瓶開始點樣于GF254硅膠2*5薄層板上，每瓶對應(yīng)一個點，每板點三個樣品點及

44、一個荷葉堿對照點，使用氯甲比為20:1為展開劑依次進行展開，將所得的薄層板使用電吹風(fēng)吹干，于254熒光燈下觀察結(jié)果。結(jié)果顯示所得樣品整體可分為5部分既瓶3—5:；6—9；10—19；21—29；30—45，根據(jù)對照判斷大體得知8號為較純荷葉堿，3-5主組份相似，6-9主組份為荷葉堿，10-19主組份相似，20-29主組份相似，30-45主組份相似。將成份相似的各組分合并，并依次標好標簽，得五瓶樣品液，靜止于通風(fēng)廚中待其揮干。</p

45、><p>　　2.2荷葉堿的細分離</p><p>　　（1）樣品的預(yù)處理及裝柱</p><p>　　將上步所得的荷葉堿主成份樣品稱重，得1.523g，使用約1ml氯仿溶解并點樣于GF254硅膠4*8薄層板上，使用氯甲比為20:1展開劑進行展開，結(jié)果顯示混合樣品略微展開，再使用氯甲比為20:1的展開劑嘗試展開，結(jié)果顯示混合樣品有較好的分離，所以決定使用氯甲比為20:1溶

46、解為洗脫劑。 </p><p>　　將樣品溶液轉(zhuǎn)移至小型蒸發(fā)皿中，稱取1g柱層析硅膠，加入蒸發(fā)皿中混合并攪拌，將蒸發(fā)皿靜止與通風(fēng)廚下，待其揮干。稱取薄層色譜柱硅膠45g，置于 250ml燒杯中，使用氯甲比為20:1的洗脫液溶解并攪拌至懸濁液，玻璃棒引流裝入小型玻璃柱中，靜止待其沉降，打開玻璃柱活塞，適量的放出少許溶劑至溶液上端略高于硅膠層2cm時關(guān)閉活塞。將蒸發(fā)皿中已揮干了溶劑的的硅膠使用研磨棒研細，并使用漏斗

47、加入玻璃柱中，盡量保持硅膠曾的平整，使用少許洗脫劑沖洗漏斗及玻璃柱壁中所粘的硅膠粉末。再稱取1.5g柱層析硅膠將其再加入柱中作為最上層的覆蓋。</p><p><b>　?。?）樣品的洗脫</b></p><p>　　加入足量洗脫劑于柱中，使用100ml錐形瓶接收洗脫液，開始沖柱，每次洗脫液接受至50ml左右換接受瓶，并將所接受的洗脫液移入200ml圓底燒瓶中進行減壓

48、蒸干，再使用少許氯仿（約1ml）溶解并移入小青霉素瓶中，再次使用少許氯仿（約1ml）沖洗燒瓶兩次，將沖洗液移入同一個青霉素瓶中，并對所對應(yīng)的青霉素瓶進行標簽編號，共28瓶。</p><p>　　（3）樣品的點樣粗分離</p><p>　　對上步所得的青霉素瓶中的溶液從第一瓶開始點樣于GF254硅膠4*8薄層板上，每瓶對應(yīng)一個點，每板點三個樣品點及一個荷葉堿對照點，使用氯甲比為10:1為展開

49、劑依次進行展開，將所得的薄層板使用電吹風(fēng)吹干，于254熒光燈下觀察結(jié)果。結(jié)果顯示所得樣品整體可分為3部分既瓶3—7:；7—16；17-28，根據(jù)對照判斷大體得知7-16號為荷葉堿。將7-16號瓶樣品合并，并置于通風(fēng)廚下?lián)]干，得純度較高荷葉堿。</p><p>　　3荷葉堿的結(jié)構(gòu)改造 </p><p>　　3.1荷葉堿1位脫甲氧基</p><p>　?。?）反應(yīng)制備荷

50、葉堿G-1</p><p>　　取三口圓底燒瓶一個，將其架于油浴上，使用磨口塞塞住左口，橡皮塞塞住右口（目的是下步注入反應(yīng)劑及催化劑），使用磨口旋塞塞住中間一口并連接上N2排氣裝置，進行氮氣排氣。</p><p>　　稱取二芐基二硒111mg（0.325mmol），使用無水DMF5ml溶解，并注入三口圓底燒瓶中。繼續(xù)啟動氮氣排氣操作，在氮氣保護下，從三口瓶左口加入150mgNaBH4，塞上

51、左口，停止氮氣排氣操作，將燒瓶置與提前升溫為60度的油浴鍋中，使用磁力攪拌器攪拌反應(yīng)二十分鐘。在反應(yīng)時間到后，將事先使用6mlDMF溶解的141mg（0.5mmol）荷葉堿使用注射器從橡皮塞口注入燒瓶，調(diào)節(jié)溫度至140度，反應(yīng)2h，停止反應(yīng)。</p><p>　　現(xiàn)象：二芐基二硒為黃色粉末，易容與DMF中，顯淡綠色，在加入NaBH4后無明顯現(xiàn)象，溫度60度下反應(yīng)二十分鐘后，溶液漸漸變?yōu)闇\棕色。當(dāng)加入荷葉堿反應(yīng)1h

52、后，溶液顯橙黃色，反應(yīng)2h后溶液顯棕色。</p><p>　?。?）分離純化荷葉堿G-1</p><p>　　使用毛細管吸取并點樣反應(yīng)所得的反應(yīng)液于2*5cmGF254薄層板，同時點荷葉堿對照，使用氯甲比20:1展開，觀察結(jié)果。結(jié)果顯示反應(yīng)有新化合物產(chǎn)生，且主產(chǎn)物極性略大于荷葉堿，推測其為荷葉堿G-1。</p><p>　　在反應(yīng)液中加入10%稀H2SO4調(diào)節(jié)PH至

53、3左右，此時觀察到燒瓶中的沉淀逐漸溶解，將溶液轉(zhuǎn)入100ml分液漏斗中，分出下層水層。使用1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)水層PH至9，發(fā)現(xiàn)析出大量沉淀，加入100ml氯仿萃取溶液兩次，將氯仿萃取液旋蒸濃縮至1ml，吸取濃縮液點樣于GF254薄層板上，并且點荷葉堿做對照，于氯甲比20:1的展開劑中展開，觀察結(jié)果。結(jié)果顯示，反應(yīng)雜質(zhì)得到初步分離，濃縮液中位荷葉堿及反應(yīng)產(chǎn)物。</p><p>　　將濃縮液點樣于20*20的

54、GF-254薄層板上，使用氯甲比為20:1的展開劑重復(fù)展開兩次，在254nm熒光下觀察與產(chǎn)物所在區(qū)帶，使用鉛筆劃出并用刮刀刮下該層。將刮下的硅膠塊研碎，裝柱于小玻璃管中，使用氯甲10:1混合溶劑充分沖柱，濃縮所得洗脫液，將濃縮液轉(zhuǎn)移至青霉素瓶中，點樣于小GF254薄層板上，并點荷葉堿對照，使用氯甲比20:1展開，觀察濃縮液是否較純，結(jié)果顯示反應(yīng)主產(chǎn)物的到有效的濃縮，純度較高。待其風(fēng)干，稱重。</p><p>　　

55、3.2荷葉堿G-1二位脫甲基制荷葉堿G-2</p><p>　?。?）反應(yīng)制備荷葉堿G-2</p><p>　　取三口圓底燒瓶一個，使用磨口塞塞住左口，橡皮塞塞住右口，使用磨口旋塞塞住中間一口并連接上N2排氣裝置。</p><p>　　取青霉素瓶一個，小心稱取三氯化鋁1g，并立即蓋上瓶子瓶塞（三氯化鋁極易吸收，并且開瓶時有大量白煙生氣），稱取荷葉堿G-1的182mg

56、。</p><p>　　將反應(yīng)物投入裝置，開始反應(yīng)。 將稱量好的荷葉堿G-1加入三口圓底燒瓶中，并使用N2排氣裝置對燒瓶進行充分排氣。取5ml無水乙氰緩慢加入三氯化鋁瓶中（乙氰加入三氯化鋁時會產(chǎn)生大量煙霧，需在通風(fēng)下小心進行，并需不斷攪拌，防止三氯化鋁結(jié)塊），使用10ml注射器吸取乙氰三氯化鋁混合液，從橡皮塞一口注入圓底燒瓶中，再使用5ml乙氰洗滌三氯化鋁小瓶兩次，均吸取并注入圓底燒瓶中。開啟磁力攪拌器，在室溫

57、下反應(yīng)24h。</p><p>　　反應(yīng)24h后，使用毛細管吸取少量反應(yīng)底液，點樣于4*8cmGF254硅膠薄層板上，并點荷葉堿G-1為對照，使用氯甲比為10:1展開液進行展開。展開結(jié)果顯示反應(yīng)得到了預(yù)期的產(chǎn)物，產(chǎn)率約為60%。使用滴管吸取少許蒸餾水，加入反應(yīng)裝置，崔滅反應(yīng)。</p><p>　　（2）分離純化荷葉堿G-2</p><p>　　在上步終止的反應(yīng)中滴加

58、鹽酸，調(diào)節(jié)PH至2-3（目的是將生物堿溶入水相易于分離），將混合液移入100ml分液漏斗，靜止待其分層分液。在滴加鹽酸過程中，反應(yīng)液起始顏色為棕黃色，在滴加過程中出現(xiàn)分層現(xiàn)象，有機相顏色變淡，溶液乳化嚴重。</p><p>　　靜止后，發(fā)現(xiàn)溶液乳化層任存在，所以使用2000r/min離心機離心30min，再移入100ml分液漏斗分離。通過密度比對得知上層液位有機相，下層液為水相，放出下層水相于100ml燒杯中。&

59、lt;/p><p>　　緩慢滴加2Mol/L NaOH溶液于燒杯中，調(diào)節(jié)PH至9左右。此步PH值不可調(diào)太高，因為反應(yīng)預(yù)期所得的產(chǎn)物荷葉堿G-2會存在兩個相連的酸性苯羥基，如果調(diào)節(jié)PH過高會使其繼續(xù)溶解于水相中而是產(chǎn)物損失嚴重。在滴加NaOH溶液時發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生大量白的沉淀，初步估計為鋁鹽和少量反應(yīng)產(chǎn)物。</p><p>　　將調(diào)解好PH的水溶液移入50ml的分液漏斗中，加入10ml氯仿進行對荷葉堿G

60、-1和荷葉堿G-2的萃取。萃取是溶液乳化嚴重，所以使用2000r/min離心機離心30min，分出有機層，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至2ml左右，使用毛細管吸取少量濃縮液，點樣于GF-254薄層板上，放置于254nm熒光下進行觀察點樣結(jié)果，結(jié)果顯示有機相中不存在反應(yīng)物G-1和荷葉堿G-2。隨取樣風(fēng)干的沉淀物少量，使用氯甲比為10：1的混合溶劑溶解，使用毛細管吸取少量溶液，點樣于GF-254薄層板上，放置于254nm熒光下進行觀察點樣結(jié)果，結(jié)

61、果顯示沉淀物中可能存在產(chǎn)物，繼續(xù)點樣荷葉堿G-1和荷葉堿G-2作為對照，使用氯甲比為10:1的混合溶劑做展開劑進行展開。結(jié)果顯示混合物有較好的展開分離，反應(yīng)產(chǎn)物存在于沉淀物中。將沉淀風(fēng)干，進行進一步分離產(chǎn)物。</p><p>　　將上步所得的沉淀混合0.5g柱層析硅膠，加入蒸發(fā)皿中攪拌均勻。稱取薄層色譜柱硅膠30g，置于 100ml燒杯中，使用氯甲比為10:1的洗脫液溶解并攪拌至懸濁液，玻璃棒引流裝入小型玻璃柱中

62、，靜止待其沉降，打開玻璃柱活塞，適量的放出少許溶劑至溶液上端略高于硅膠層1cm時關(guān)閉活塞。將蒸發(fā)皿中的粉末使用漏斗加入玻璃柱中，盡量保持硅膠曾的平整，使用少許洗脫劑沖洗漏斗及玻璃柱壁中所粘的硅膠粉末。再稱取1g柱層析硅膠將其再加入柱中作為最上層的覆蓋。</p><p>　　加入足量洗脫劑于柱中，使用100ml錐形瓶接收洗脫液，開始沖柱，每次洗脫液接受至30ml左右換接受瓶，并將所接受的洗脫液移入100ml圓底燒瓶

63、中進行減壓蒸干，再使用少許洗脫劑（約1ml）溶解并移入小青霉素瓶中，再次使用少許洗脫劑（約1ml）沖洗燒瓶兩次，將沖洗液移入同一個青霉素瓶中，并對所對應(yīng)的青霉素瓶進行標簽編號。</p><p>　　對上步所得的青霉素瓶中的溶液從第一瓶開始點樣于GF254硅膠4*8薄層板上，每瓶對應(yīng)一個點，每板點兩個樣品點及一個荷葉堿G-1和一個荷葉堿G-2對照點，使用氯甲比為10:1為展開劑依次進行展開，將所得的薄層板使用電吹風(fēng)

64、吹干，于254熒光燈下觀察結(jié)果。結(jié)果顯示17至19號瓶中存在反應(yīng)產(chǎn)物，將它們合并濃縮至1ml左右。使用毛細管將濃縮液點樣于20*20cm的GF-254硅膠薄層板上，使用氯甲比為10:1的混合溶劑展開。將展開后的薄層板吹干，置于254nm熒光下觀察并使用鉛筆畫出荷葉堿G-2所在的區(qū)帶。</p><p>　　將上步畫出的區(qū)帶用掛刀掛下，填柱于小型號玻璃柱中，使用足量甲醇溶液沖洗，濃縮沖洗液，并移入下青霉素瓶，風(fēng)干的荷

65、葉堿G-2.。稱重得m=5.3mg。</p><p><b>　　三、結(jié)果與分析</b></p><p>　?。ㄒ唬⑸飰A提取結(jié)果</p><p><b>　　荷葉總堿：2.8g</b></p><p>　　荷葉堿： 1.523g</p><p>　　荷葉總堿中荷葉堿為主成

66、份，試驗中使用柱硅膠層析使荷葉堿得得到了較好的分離，而荷葉總堿中的其他成分，經(jīng)后續(xù)分離只獲得了一種個物質(zhì)，剩余的其它成份因含量較少而未得到分離純化。</p><p>　?。ǘ⒑扇~堿G-1制備結(jié)果</p><p>　　在荷葉堿G-1的制備實驗中，荷葉堿得到了較好的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率約在68%，其中有兩種產(chǎn)物,一種為主產(chǎn)物既荷葉堿G-1，另一種為雜質(zhì)，含量較少。</p><p

67、>　　荷葉堿： 0.141g</p><p>　　荷葉堿G-1：0.097g</p><p>　?。ㄈ⒑扇~堿G-2制備結(jié)果</p><p>　　在荷葉堿G-2的制備實驗中，荷葉堿G-1的轉(zhuǎn)化較好，反應(yīng)安全性較高，轉(zhuǎn)化率約在60%左右,反應(yīng)較專一，無副產(chǎn)物出現(xiàn)。</p><p>　　荷葉堿G-1：0.182g</p>

68、<p>　　荷葉堿G-2:0.0053g</p><p><b>　　四、討論</b></p><p>　　在實驗初期荷葉堿的提取過程中，本次實驗使用乙醇提取荷葉，進而酸提堿沉氯仿萃獲得荷葉總堿，那么我們也可以考慮直接使用強酸水溶液進行提取，再進行堿沉，氯仿萃，進而獲得荷葉總堿，省去了好多步驟。</p><p>　　在荷葉堿細分離

69、及后續(xù)的合成產(chǎn)物分離過程中，考慮物質(zhì)是否被硅膠柱所吸附而不能被有效的洗脫，經(jīng)過對比發(fā)現(xiàn)目前此些物質(zhì)并無明顯吸附，但后續(xù)的氮脫甲基結(jié)構(gòu)改造物可能會出現(xiàn)吸附。因此，在分離純化氮脫甲基化合物時要加入少量的三乙胺。</p><p>　　在荷葉堿G-2的制備過程中，由于后續(xù)的分離工作工序多步，進而導(dǎo)致最終所得的產(chǎn)物比反應(yīng)所得的產(chǎn)物要少的多，應(yīng)重新考慮此反應(yīng)的產(chǎn)物純化方式，以提高有效收率。</p><p&

70、gt;　　因后續(xù)工作還要進行荷葉堿結(jié)構(gòu)的系列改造，因此在查找參考反應(yīng)時因考慮到此點，盡量發(fā)現(xiàn)反應(yīng)產(chǎn)率高、反應(yīng)安全性高、反應(yīng)要求低、反應(yīng)產(chǎn)物易分離的改造反應(yīng)。</p><p><b>　　五、結(jié)論</b></p><p>　　本次實驗系統(tǒng)的進行了荷葉堿的提取、分離、純化，獲得了較大量的高純度荷葉堿。在荷葉堿的結(jié)構(gòu)改造中，兩步實驗都有較高產(chǎn)率，達到了實驗的目的，也為下步的

71、進一步結(jié)構(gòu)改造奠定了基礎(chǔ)。本實驗的后期還要在荷葉堿G-2的基礎(chǔ)上進氮上脫甲基，氮上連接丙基、異丙基、甲?；炔僮鳌Ｔ讷@得五個及五個以上結(jié)構(gòu)改造物后，進行酶標法測定各組改造物活性，進而對比發(fā)現(xiàn)高活性化合物，且可進一步指導(dǎo)下一步的實驗，最終達到獲得新型高效、專一的乙酰膽堿酯酶抑制劑。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1]鄒壘，全明海，程

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