大、小鼠來源日本血吸蟲凋亡相關基因的差異表達分析及Sjcaspase3-7的克隆、真核表達和生物學功能分析.pdf

1、日本血吸蟲病是一種危害嚴重的人畜共患寄生蟲病，仍是我國重要的公共衛(wèi)生問題之一。截止到2013年底，我國仍推算有血吸蟲病人18多萬例。至今，仍沒有理想的血吸蟲病疫苗可在現(xiàn)場應用，血吸蟲病防治仍主要依靠大規(guī)模的吡喹酮化療，且已有血吸蟲對吡喹酮產(chǎn)生抗藥性的報道。因此，迫切需要篩選治療血吸蟲病新藥物。細胞凋亡是細胞程序性死亡的一種主要方式，日本血吸蟲細胞凋亡的研究可為日本血吸蟲新藥靶的篩選提供新思路。
　　本研究通過對日本血吸蟲全基因組信

2、息挖掘，鑒定了15個日本血吸蟲凋亡相關基因。通過RT-PCR技術分析了這些凋亡相關基因在適宜性宿主BALB/c小鼠和非適宜性宿主Wistar大鼠來源的不同時期的日本血吸蟲中的轉(zhuǎn)錄水平和表達差異，對其中重要的差異表達基因 Sjcaspase3/7進行了克隆、真核表達及生物學功能分析，為深入研究日本血吸蟲凋亡機制和新藥靶的鑒定奠定了基礎。
　　1.大、小鼠來源日本血吸蟲凋亡相關基因的表達分析
　　分別收集了BALB/c小鼠和Wi

3、star大鼠來源14d,23d,32d,42d四個時期共八組日本血吸蟲蟲體，利用Trizol提取蟲體的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用日本血吸蟲全基因組本地BLAST數(shù)據(jù)庫搜索，共獲得了15個與日本血吸蟲細胞凋亡相關的基因。通過RT-PCR分析了這15個凋亡相關基因在不同宿主和不同期別的表達情況。初步分析結(jié)果表明兩種宿主來源的日本血吸蟲凋亡相關基因的表達情況存在差別，其中早期（14d）蟲體中凋亡基因表達差異較小，但自23d起，大鼠來源蟲

4、體中凋亡相關基因高表達數(shù)量明顯高于小鼠來源蟲體，這可能是影響日本血吸蟲在非適宜性宿主大鼠體內(nèi)生長發(fā)育的重要因素之一。進一步分析表明日本血吸蟲至少存在一條完整但相對簡單的內(nèi)源性凋亡通路（線粒體通路）。本研究為深入研究日本血吸蟲與宿主的相互作用機制和日本血吸蟲的凋亡機制奠定了基礎。
　　2.日本血吸蟲Sjcaspase7的克隆、真核表達及生物學功能分析
　　本研究對日本血吸蟲凋亡基因 Sjcaspase7進行了克隆并成功構建了真

5、核表達質(zhì)粒 pXJ40-FLAG-Sjcaspase7。IFA結(jié)果顯示Sjcaspase7成功在Hela細胞中表達。Western Blotting結(jié)果分析表明重組蛋白Sjcaspase7分子量約為36KDa。Caspase酶活檢測實驗結(jié)果表明rSjcaspase7重組蛋白具有切割底物DEVD的活性，同時該活性可以被抑制劑Z-DEVD-FMK所抑制。流式細胞術分析結(jié)果表明Sjcaspase7可誘導Hela發(fā)生早期細胞凋亡。通過體外RNA

6、干擾篩選首先得到一組對Sjcaspase7干擾效果明顯的小干擾 RNA(SiRNA-883)。體內(nèi)干擾實驗也證明了 SiRNA-883對日本血吸蟲Sjcaspase7的表達具有一定的干擾效果。動物實驗結(jié)果表明：與對照組相比，蟲體Sjcaspase7基因下調(diào)表達了32.59％；干擾組蟲荷數(shù)和肝臟蟲卵數(shù)分別下降了30.77%和28.85%。同時，對各組蟲體Caspase酶活檢測發(fā)現(xiàn)干擾組酶活比對照組下降了89.73%，結(jié)果表明Sjcaspa

7、se7對日本血吸蟲的生長和發(fā)育產(chǎn)卵可能具有重要作用。本研究為深入研究日本血吸蟲凋亡基因Sjcaspase7的生物學功能及日本血吸蟲的凋亡機制奠定了理論基礎。
　　3.日本血吸蟲Sjcaspase3的克隆、真核表達及生物學功能分析
　　利用PCR技術擴增獲得Sjcaspase3基因的編碼序列，其ORF含900bp，編碼299個氨基酸，理論分子量為33509.7Da，理論等電點為6.39。Real-time PCR分析表明該基因

8、在檢測的各階段日本血吸蟲中普遍表達，其中21d表達量最高，42d雌蟲表達量高于42d雄蟲。成功構建了pXJ40-FLAG-Sjcaspase3重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染到 Hela細胞內(nèi)，熒光定量 PCR和 Western Blotting分析表明Sjcaspase3成功在Hela細胞中表達。酶活實驗提示重組rSjcaspase3蛋白具有切割特異性底物天冬氨酸-谷氨酸-纈氨酸-天冬氨酸（DEVD）的活性。流式細胞術分析表明Sjcaspase3可誘導