淡水甲殼類動(dòng)物新型病原——中華絨螯蟹螺原體菌體蛋白模擬表位的研究及快速檢測方法的建立.pdf

1、蝦蟹是我國重要的經(jīng)濟(jì)水生甲殼動(dòng)物，也是出口創(chuàng)匯的重要水產(chǎn)養(yǎng)殖品種。伴隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展的同時(shí)，病害造成的經(jīng)濟(jì)損失也越來越大，其中顫抖病是中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）最嚴(yán)重的流行病之一。2002年王文等首次在水生動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)致病性螺原體，2004年根據(jù)“科霍法則”確定其為中華絨螯蟹顫抖病的病原體，隨后又發(fā)現(xiàn)該螺原體還可導(dǎo)致南美白對蝦(Penaeus vannamei)、克氏原螯蝦(Procambarus clar

2、kia)的大規(guī)模死亡，2010年正式將其命名為中華絨螯蟹螺原體（Spiroplasma eriocheiris）。對于這一新型病原微生物的生物學(xué)特性、致病機(jī)制、防治方法等諸多方面急需深入系統(tǒng)研究。本論文應(yīng)用免疫學(xué)技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)、噬菌體展示肽庫篩選技術(shù)等針對中華絨螯蟹螺原體開展研究，并獲得以下主要結(jié)果:
　　1、抗中華絨螯蟹螺原體系列單抗及多抗的制備及鑒定
　　分別用中華絨螯蟹螺原體（S.eriocheiris）菌懸液及

3、全菌體蛋白免疫Balb/c小鼠，按常規(guī)方法融合，得到20株穩(wěn)定分泌抗S.eriocheiris抗體的雜交瘤細(xì)胞株，從中挑選4株連同本實(shí)驗(yàn)室前期制備的2株雜交瘤細(xì)胞，制備、純化單克隆抗體，并進(jìn)行免疫球蛋白類型、親和力、滴度以及特異性的鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單抗5C11、5D9、6F5、12H5重鏈均為IgG1，輕鏈均為κ，單抗6H7、7C8重鏈為IgG2a，輕鏈為κ;6H7親和力最高，5D9最低;ELISA，Westernblot檢測表明，7C

4、8和6H7為S.eriocheiris特異性單抗，其余4株單抗與S.eriocheiris發(fā)生結(jié)合，同時(shí)與S.mirum、S.melliferum出現(xiàn)交叉反應(yīng);6株單抗均與江蘇省八個(gè)不同地區(qū)分離的S.eriocheiris菌株結(jié)合。多克隆抗體與S.eriocheiris結(jié)合，同時(shí)與S.mirum、Smelliferum以及解尿脲原體（U.urealyticum）出現(xiàn)交叉反應(yīng)。
　　2、中華絨螯蟹螺原體特定功能蛋白模擬表位的篩選及鑒

5、定
　　通過制動(dòng)、變形等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單抗6F5、7C8、12H5使S.eriocheiris形態(tài)發(fā)生明顯改變，多數(shù)螺旋結(jié)構(gòu)消失，光鏡下呈散點(diǎn)狀;單抗5D9及混合單抗使S.eriocheiris運(yùn)動(dòng)性部分喪失，光鏡下見其運(yùn)動(dòng)較呆板，在液面呈漂浮狀。在此基礎(chǔ)上，首先以S.eriocheiris特異性單抗6H7為靶分子篩選噬菌體展示十二肽庫，獲得一致性插入序列:FQGINHYNQMER，通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該序列與S.eriochei

6、ris的類粘附蛋白(ALP)具有一定的同源性;Westernblot結(jié)果表明單抗6H7能夠與ALP結(jié)合;ELISA結(jié)果顯示，展示該序列的噬菌體肽能夠與6H7特異性結(jié)合，并且呈現(xiàn)劑量依賴性，S.eriocheiris能夠競爭抑制這種結(jié)合;免疫電鏡發(fā)現(xiàn)單克隆抗體6H7能夠與S.eriocheiris菌體表面結(jié)合。隨后采用相同的篩選策略，以能夠使S.eriocheiris發(fā)生形態(tài)改變的6F5，7C8，12H5三種單抗混合物作為靶分子進(jìn)行肽庫的

7、篩選，獲得9種不同的氨基酸序列，通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)噬菌體克隆NM4.32和NM4.38的共有序列YMRDMQSGLPRY與S.eriocheiris及S.mirum的細(xì)胞形狀決定蛋白(MreB)具有很高的同源性;噬菌體克隆NM4.39的序列與非凡螺原體細(xì)胞分裂蛋白(FtsZ)有一定程度的同源性。
　　3、中華絨螯蟹螺原體快速檢測方法的研究
　　應(yīng)用所制備的單克隆抗體及多克隆抗體建立了雙抗夾心ELISA檢測方法。該方法對