農(nóng)業(yè)有害微生物的綠色控制方法研究——外源羥基自由基殺滅機(jī)理和植物內(nèi)源抗病基因克隆研究.pdf

1、農(nóng)業(yè)有害微生物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)會(huì)對(duì)農(nóng)作物和農(nóng)產(chǎn)品造成污染，這不僅導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)、農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，而且有些病原性微生物會(huì)產(chǎn)生毒素，甚至引發(fā)流行性疾病。同時(shí)，農(nóng)業(yè)有害微生物還會(huì)污染環(huán)境，對(duì)人類(lèi)造成長(zhǎng)期的潛在危險(xiǎn)，影響到社會(huì)穩(wěn)定乃至國(guó)民經(jīng)濟(jì)的持續(xù)發(fā)展。目前，我國(guó)防治農(nóng)業(yè)有害微生物的方法多樣，但在實(shí)際應(yīng)用中均存在有不同的缺陷，如殺滅不完全，尤其是對(duì)一些產(chǎn)芽孢的烈性致病細(xì)菌的控制非常困難;大多數(shù)化學(xué)方法處理難以避免存在環(huán)境污

2、染問(wèn)題等。
　　 論文提出利用綠色技術(shù)控制農(nóng)業(yè)有害微生物，如可利用高級(jí)氧化技術(shù)，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)原料、廢棄物和排泄物等進(jìn)行滅菌，也可對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品儲(chǔ)藏室進(jìn)行消毒。同時(shí)，可通過(guò)培育和推廣作物抗病品種，在農(nóng)作物收獲前就控制病原菌，從而低成本高效益地預(yù)防、消除或減小農(nóng)業(yè)有害微生物造成的危害。
　　 論文的研究?jī)?nèi)容主要包括以下兩部分:
　　 第一部分，農(nóng)業(yè)有害微生物的外源性羥基自由基控制研究
　　 高級(jí)氧化技術(shù)

3、(AOT)可通過(guò)反應(yīng)產(chǎn)生極具氧化性的羥基自由基，它幾乎能和所有的生物大分子、有機(jī)物和無(wú)機(jī)物發(fā)生不同類(lèi)型的化學(xué)反應(yīng)，直至徹底轉(zhuǎn)化為二氧化碳和水等無(wú)害物質(zhì)。論文采用強(qiáng)電場(chǎng)電離放電法制備高濃度羥基自由基，以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和芽孢為模型，研究外源性羥基自由基對(duì)農(nóng)業(yè)有害微生物的生物學(xué)效應(yīng)及作用機(jī)理，具體內(nèi)容如下:
　　 1、外源性羥基對(duì)G-細(xì)菌的殺滅效應(yīng)及作用機(jī)制
　　 研究以大腸桿菌為模型，采用不同濃度的外源性羥基自由基處

4、理大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)羥基濃度超過(guò)0.4mg/L時(shí)即能導(dǎo)致其全部死亡，這表明羥基濃度對(duì)G-細(xì)菌有高效的殺滅作用。對(duì)生物大分子含量及完整性的分析表明，羥基能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)損傷DNA、RNA和蛋白質(zhì)。對(duì)胞內(nèi)電解質(zhì)滲漏率和膜脂氧化程度的分析表明，羥基能直接對(duì)細(xì)胞膜造成重大損傷。掃描電鏡和透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用0.2mg/L羥基溶液處理時(shí)，細(xì)菌形態(tài)扭曲，細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間出現(xiàn)明顯的空隙;當(dāng)用1.0mg/L羥基溶液處理時(shí)，細(xì)菌保持桿狀，但細(xì)胞壁上出現(xiàn)不規(guī)則

5、褶皺。羥基處理還使胞內(nèi)的擬核變得模糊，甚至消失。綜合上述結(jié)果，外源性羥基自由基不僅能損傷細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等外部結(jié)構(gòu)，也能損傷胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和胞內(nèi)生物大分子，從而導(dǎo)致G-細(xì)菌死亡。
　　 2、外源性羥基對(duì)G+細(xì)菌及芽孢的殺滅效應(yīng)及作用機(jī)制。
　　 致死效應(yīng)研究表明，羥基也能有效殺滅枯草芽孢桿菌及芽孢，但完全殺滅它們所需的濃度分別為0.8mg/L和1.0mg/L，遠(yuǎn)高于殺滅大腸桿菌所需的濃度(0.4mg/L)，這可能是由于枯草芽孢桿

6、菌及芽孢的外壁比大腸桿菌厚造成的。電鏡結(jié)果顯示，不同濃度的羥基處理枯草芽孢桿菌時(shí)，菌體基本保持桿狀，但其表面會(huì)出現(xiàn)褶皺，用0.2mg/L羥基溶液處理時(shí)，僅少數(shù)菌體表面出現(xiàn)褶皺，當(dāng)羥基濃度提高至1.0mg/L時(shí)，所有菌體表面出現(xiàn)大量規(guī)則的豎條形紋路，超薄切片觀察顯示，胞內(nèi)的擬核變模糊。對(duì)芽孢的掃描電鏡觀察表明，0.4mg/L羥基溶液不會(huì)引起芽孢表面結(jié)構(gòu)的變化，而當(dāng)羥基濃度提高到1.0mg/L時(shí)，芽孢體積大為縮小，不足正常芽孢的1/9，并在

7、芽孢全周布滿凸起物。透射電鏡結(jié)果顯示，受損芽孢的外部結(jié)構(gòu)呈解體狀態(tài)，而芽孢內(nèi)部呈深色，表明其致密度很高。由此推測(cè)，G+細(xì)菌的細(xì)胞壁和芽孢的芽孢壁等都是外源性羥基自由基的攻擊靶標(biāo)。
　　 3、利用綠色熒光蛋白監(jiān)測(cè)外源性羥基對(duì)大腸桿菌的殺滅效果。
　　 研究采用基因工程技術(shù)制備了重組綠色熒光蛋白(EGFP)，并構(gòu)建了能組成型表達(dá)EGFP的工程菌E.coli-EGFP。離體研究表明，羥基溶液能有效淬滅重組EGFP的綠色熒光，當(dāng)

8、羥基濃度為0.2mg/L時(shí)，綠色熒光強(qiáng)度可降至48.25％，當(dāng)羥基濃度增加到0.4mg/L以上時(shí)，綠色熒光基本消失。菌體研究表明，當(dāng)羥基濃度為0.3mg/L時(shí)，工程菌的熒光強(qiáng)度可減至33.22％，當(dāng)羥基濃度超過(guò)0.8mg/L時(shí)，熒光信號(hào)基本消失。結(jié)合工程菌的死亡率數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，用0.2-1.0mg/L羥基溶液處理工程菌時(shí)，相對(duì)熒光強(qiáng)度與工程菌死亡率存在相關(guān)性，符合曲線方程:y=0.0009x2-0.0276x+0.0525(R2=0.992

9、3)。該結(jié)果表明，借助工程菌胞內(nèi)EGFP的熒光強(qiáng)度，可監(jiān)測(cè)羥基溶液殺滅大腸桿菌是否徹底。
　　 第二部分，農(nóng)作物病原微生物的基因控制研究
　　 培育和推廣抗病品種是防治作物病害最經(jīng)濟(jì)、安全和有效的途徑，其關(guān)鍵在于發(fā)掘和利用新的抗性資源。小麥白粉病是小麥三大病害之一，嚴(yán)重威脅著小麥生產(chǎn)。小麥野生近緣物種簇毛麥所攜帶的抗白粉病基因Pm21是目前最優(yōu)秀的小麥白粉病抗源，但對(duì)其遺傳基礎(chǔ)尚缺乏足夠的認(rèn)識(shí)。論文借助比較基因組學(xué)高效開(kāi)

10、發(fā)攜帶Pm21基因的6VS缺失片段FL0.45-0.58及附近的CISP標(biāo)記，構(gòu)建高密度比較基因組圖譜，進(jìn)而采用RGA克隆法獲得Pm21候選基因。研究的主要內(nèi)容如下:
　　 1、簇毛麥抗白粉病基因Pm21的精細(xì)定位
　　 論文對(duì)已報(bào)道的4個(gè)6VS標(biāo)記進(jìn)行缺失定位，將攜帶Pm21基因的缺失片段FL0.45-0.58定位于標(biāo)記Xcinau(l)88和CINAU91之間。對(duì)現(xiàn)有的12個(gè)6VS標(biāo)記在二穗短柄草基因組中進(jìn)行電子定位

11、，構(gòu)建低密度比較基因組圖譜。選擇二穗短柄草第3號(hào)染色體短臂(3BdS)上連續(xù)的200個(gè)基因作為目標(biāo)區(qū)，經(jīng)共線性分析后，針對(duì)其中的69個(gè)基因設(shè)計(jì)了94對(duì)CISP引物，篩選到22個(gè)6VS特異性CISP標(biāo)記。缺失定位分析表明，4個(gè)CISP標(biāo)記定位于缺失片段FL0.58-1.0，10個(gè)定位于FL0.45-0.58，8個(gè)定位于FL0-0.45，從而將攜帶Pm21基因的FL0.45-0.58精細(xì)定位于CISP標(biāo)記6VS-CISP027與6VS-CI

12、SP145之間，并構(gòu)建了高密度比較基因組圖譜。
　　 2、采用RGA克隆法克隆Pm21候選基因
　　 研究以植物R基因保守的NBS結(jié)構(gòu)域作為種子序列，對(duì)二穗短柄草全基因組中的R基因進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)全基因組中存在299個(gè)R基因，其中3BdS染色體上有30個(gè)R基因，其結(jié)構(gòu)以CC-NBS-LRR和NBS-LRR為主。根據(jù)高密度比較基因組圖譜，將二穗短柄草的R5-R8基因視為簇毛麥Pm21基因的同源物，針對(duì)其保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，

13、采用RGA克隆法從簇毛麥中獲得3個(gè)R基因片段。缺失定位分析表明，僅Hv-R1基因定位于缺失片段FL0.45-0.58。利用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析，發(fā)現(xiàn)Hv-R1基因能組成型表達(dá)，并受白粉菌誘導(dǎo)增強(qiáng)表達(dá)。利用TAIL-PCR技術(shù)獲得完整的Hv-R1基因，全長(zhǎng)為5309bp，編碼區(qū)為2568bp，其中內(nèi)含子為250bp。Hv-R1基因編碼的蛋白質(zhì)為855個(gè)氨基酸殘基，與二穗短柄草R5-R7基因的編碼蛋白具有很高的同源性(72％-77％

14、)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析表明，簇毛麥Hv-R1基因?yàn)榈湫偷腃C-NBS-LRR類(lèi)R基因。啟動(dòng)子模序分析發(fā)現(xiàn)，Hv-R1基因上游除了CAAT-box和TATA-box，還有W-box、MYB和MYC轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別位點(diǎn)等多種抗病相關(guān)的啟動(dòng)子模序，它們可能對(duì)Hv-R1基因起重要的調(diào)控作用。研究不僅為Pm21候選基因的功能鑒定奠定了良好的基礎(chǔ)，也為克隆孤兒作物中的目的基因提供了新的思路和方法。
　　 研究揭示了外源性羥基自由基殺滅大腸桿菌、枯