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文檔簡介
1、近年來,隨著新型環(huán)境污染物的提出,含氟污染物作為其中重要的一大類正逐步引起國內(nèi)外的重視。在眾多的含氟污染物中,有兩類因其自身的特點,受到較高的關(guān)注。一類是全氟化合物(PFAAs),被廣泛地應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)和生活消費領(lǐng)域。它們的難降解性,存在持久性和強生物蓄積性,已對全球范圍的環(huán)境和生態(tài)系統(tǒng)造成了污染,并對包括人類在內(nèi)的生態(tài)系統(tǒng)中的各種生物構(gòu)成了潛在的威脅。另一類是氟喹諾酮類藥物(FQs),作為一種人用和獸用藥物,由于該類藥物在體內(nèi)的不完全
2、吸收和傳統(tǒng)水處理方法的弊端,使得該類藥物的原形化合物及其代謝產(chǎn)物進(jìn)入各種水體、土壤等環(huán)境介質(zhì)中。長期富集后的藥物殘留物通過食物鏈影響動植物和微生物的正常生命活動,對生物體造成嚴(yán)重的毒性脅迫,進(jìn)而對人類健康造成不良影響。
這兩類外源化合物經(jīng)呼吸道、消化道和皮膚接觸等途徑進(jìn)入生物體后,可能引發(fā)機體各組織和器官的損傷,導(dǎo)致機體代謝紊亂。這些污染物進(jìn)入機體后首先與體液接觸,通過循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)行運輸,在這些過程中污染物會與組織液、血液中
3、的蛋白和酶分子發(fā)生相互作用,誘發(fā)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能變化,進(jìn)而引起細(xì)胞損傷。蛋白質(zhì)是生物體各種功能的直接執(zhí)行者,而細(xì)胞是生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位,因此,從蛋白質(zhì)分子和細(xì)胞兩個層面建立這兩類含氟污染物轉(zhuǎn)運過程毒性微觀機制的研究是十分必要的。
本論文在已有的研究結(jié)果的基礎(chǔ)上,以分析化學(xué)和環(huán)境毒理學(xué)為背景,選取了具有代表性的全氟化合物(全氟戊酸PFPA、全氟辛酸PFOA和全氟癸酸PFDA)和氟喹諾酮類藥物(環(huán)丙沙星CPFX和恩諾沙
4、星ENFX),從分子和細(xì)胞兩個層面考察了這兩類含氟污染物轉(zhuǎn)運過程中的毒性作用機理及同類含氟污染物同系物之間的毒性作用規(guī)律。論文主要包括以下五個部分:
論文第一章簡要介紹了新型環(huán)境污染物的概念,闡明了全氟化合物和氟喹諾酮類藥物這兩類含氟污染物的使用現(xiàn)狀,概述了這兩類污染物的具體環(huán)境分布特點及污染現(xiàn)狀,對目前兩類含氟污染物展開的毒性研究進(jìn)展和毒性評價方法進(jìn)行了具體介紹。在文獻(xiàn)綜述的基礎(chǔ)上,分析了目前這兩類含氟污染物毒性評價中存
5、在的問題,提出了在體外條件下從分子和細(xì)胞兩個層面建立兩類含氟污染物的轉(zhuǎn)運過程毒性的評價方法。
論文第二章以轉(zhuǎn)運過程中的胞外蛋白為靶分子,從分子水平上評價了三種全氟化合物(PFPA、PFOA和PFDA)和兩種氟喹諾酮類藥物(CPFX和ENFX)分別對牛血清白蛋白(BSA)的毒性作用機理及同系物之間的作用規(guī)律,并基于FQs的藥理學(xué)特性,采用光譜學(xué)方法考察了CPFX和ENFX對轉(zhuǎn)運過程的非特異性免疫蛋白溶菌酶的毒性作用。
6、 1)利用熒光光譜、同步熒光光譜、圓二色譜等光譜學(xué)手段和熱力學(xué)計算評價了不同碳鏈長度的三種全氟化合物(PFPA、PFOA和PFDA)對BSA的毒性作用規(guī)律。從熒光光譜和圓二色譜的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),PFPA對BSA的結(jié)構(gòu)影響不大,而PFOA和PFDA均通過氫鍵和范德華力與BSA結(jié)合,使BSA的內(nèi)源熒光發(fā)生了明顯的猝滅作用,并使蛋白的骨架變得松散。其中,碳鏈較長的PFDA對BSA的毒性作用更強。
2)以BSA為靶分子,利用多
7、種光譜學(xué)手段及分子模擬手段評價了ENFX及其主要代謝產(chǎn)物CPFX的毒性作用特點。研究發(fā)現(xiàn),二者均能使BSA的內(nèi)源熒光發(fā)生明顯的猝滅作用,并生成了FQ-BSA復(fù)合物。熱力學(xué)公式計算表明,CPFX和ENFX均通過靜電作用與BSA發(fā)生結(jié)合,并且CPFX與BSA之間的作用力要大于ENFX。利用分子對接模擬技術(shù)進(jìn)一步確定CPFX(ENFX)與BSA的結(jié)合位置位于BSA位點Ⅱ區(qū)的正電荷氨基酸殘基區(qū)域。而紫外可見吸收光譜和圓二色譜的研究結(jié)果表明,CP
8、FX和ENFX使BSA的二級結(jié)構(gòu)和氨基酸殘基周圍的微環(huán)境發(fā)生了改變。
3)溶菌酶作為體液內(nèi)重要的非特異性免疫蛋白,參與機體內(nèi)的多項免疫反應(yīng)。攝入后的污染物會對其結(jié)構(gòu)和功能的表達(dá)造成影響。因此,本部分從分子水平探討了兩種具有藥理特性的CPFX和ENFX對溶菌酶結(jié)構(gòu)的影響。光譜學(xué)手段結(jié)合分子模擬技術(shù)的研究結(jié)果表明,兩種FQs均與溶菌酶活性中心附近的Trp62和Trp63氨基酸殘基發(fā)生了作用,誘發(fā)溶菌酶的熒光發(fā)生了明顯的猝滅。通
9、過熱力學(xué)常數(shù)計算分析得出,它們之間的結(jié)合力主要為氫鍵和范德華力,并且ENFX的結(jié)合要大于CPFX,此結(jié)論在分子模擬結(jié)果中得到了驗證。另外,結(jié)合的FQs均使酶分子的二級結(jié)構(gòu)和色氨基酸殘基的微環(huán)境發(fā)生了改變。
論文第三章采用光譜學(xué)結(jié)合分子模擬手段,以轉(zhuǎn)運過程中幾種胞內(nèi)蛋白為研究對象,分別探討了三種全氟化合物(PFPA、PFOA和PFDA)和兩種氟喹諾酮類藥物(CPFX和ENFX)對牛血紅蛋白(BHb)的毒性影響機制及規(guī)律。另外
10、,從分子層面考察了CPFX和ENFX對細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶(過氧化氫酶CAT和銅鋅超氧化物歧化酶Cu/ZnSOD)的結(jié)構(gòu)和功能影響。
1)通過多種光譜學(xué)手段,研究了PFPA、PFOA和PFDA與BHb的毒性作用機理。結(jié)果表明,PFPA和PFOA對BHb熒光光譜的影響很小,而PFDA能夠使BHb的熒光發(fā)生增敏作用。通過紫外可見吸收光譜和圓二色譜可以發(fā)現(xiàn),PFDA使BHb的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變,并伴隨著血紅素的暴露和高鐵血紅素的形成,從
11、而使血紅蛋白的傳輸氧能力下降。由此可見,隨著碳鏈增長,PFAAs對BHb的毒性作用增強。
2)光譜學(xué)手段與分子模擬技術(shù)的研究結(jié)果表明,CPFX和ENFX都通過靜電力與BHb發(fā)生相互作用并形成復(fù)合物,而FQs與BHb的結(jié)合位置位于BHb四個亞基之間形成的空穴中。其中,CPFX與BHb的結(jié)合作用要大于ENFX。這種結(jié)合作用誘導(dǎo)了BHb的結(jié)構(gòu)和氨基酸殘基微環(huán)境發(fā)生改變,骨架變得松散。
3)通過多種光譜學(xué)手段、酶活性
12、評價和分子模擬技術(shù),研究了CPFX和ENFX對CAT結(jié)構(gòu)和功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩種FQs均可以通過靜電作用與CAT發(fā)生結(jié)合作用形成復(fù)合物,并且二者分別與CAT結(jié)合時只有一個結(jié)合位點,均位于CAT分子中心的疏水腔內(nèi)。兩種FQs改變了CAT的二級結(jié)構(gòu),從而導(dǎo)致CAT活性中心附近的微環(huán)境發(fā)生了改變,進(jìn)而對CAT的活性產(chǎn)生了抑制作用,且CPFX對CAT的結(jié)構(gòu)和功能影響要明顯大于ENFX。
4)以Cu/ZnSOD作為靶分子,采用熒
13、光光譜、時間-分辨熒光光譜、紫外可見吸收光譜、同步熒光光譜、圓二色譜、酶活性分析和分子模擬技術(shù),考察了CPFX和ENFX對Cu/ZnSOD毒性作用機理。FQs與Cu/ZnSOD之間有較強的相互作用,通過氫鍵與范德華力與酶分子1∶1結(jié)合。FQs的結(jié)合作用誘發(fā)了酶分子的構(gòu)象改變,空間結(jié)構(gòu)變得松散,但由于結(jié)合部位對活性中心的影響相對較小,所以Cu/ZnSOD的酶分子活性變化不大。
論文第四章以人血紅細(xì)胞為研究對象,通過體外染毒,
14、從細(xì)胞水平分別考察了三種全氟化合物(PFPA、PFOA和PFDA)和兩種氟喹諾酮類藥物(CPFX和ENFX)對紅細(xì)胞抗氧化能力的影響,探討了兩類含氟污染物誘發(fā)紅細(xì)胞氧化應(yīng)激效應(yīng)的毒性作用規(guī)律。另外,結(jié)合第三章中抗氧化酶分子的實驗結(jié)果,通過比較分子和細(xì)胞水平的酶活性指標(biāo),探討了CPFX和ENFX誘發(fā)紅細(xì)胞的氧化應(yīng)激機制與抗氧化酶分子結(jié)構(gòu)和功能改變之間的相關(guān)性。
1)通過測定紅細(xì)胞中氧化應(yīng)激的五種生物學(xué)指標(biāo)(GSH、MDA、C
15、AT、SOD和GSH-Px)發(fā)現(xiàn),PFPA、PFOA和PFDA誘發(fā)紅細(xì)胞發(fā)生了氧化應(yīng)激作用,表現(xiàn)為GSH含量的降低,MDA含量隨著染毒濃度的增加而增大,而CAT、SOD、GSH-Px的酶活性在低染毒濃度下變化不大,隨著作用濃度的增加,酶活性相應(yīng)受到抑制,同時隨著碳鏈長度的增加,這五種指標(biāo)的變化程度逐漸增大,這說明PFDA的毒性作用要明顯大于PFOA和PFPA,與分子水平的考察結(jié)果相一致。
2)從CPFX和ENFX對人血紅細(xì)
16、胞的抗氧化能力的考察中發(fā)現(xiàn),CPFX和ENFX均能影響紅細(xì)胞的抗氧化能力,表現(xiàn)為GSH含量隨著染毒濃度的增加而下降,MDA水平呈現(xiàn)上升的趨勢,其中,CPFX的毒性作用要大于ENFX。而CAT、SOD和GSH-Px的酶活性在低濃度染毒劑量下表現(xiàn)為誘導(dǎo)促進(jìn)效應(yīng),而高濃度下表現(xiàn)為抑制效應(yīng),并且具有統(tǒng)計學(xué)顯著性特點。
3)通過比較分子和細(xì)胞水平上關(guān)于兩種FQs對抗氧化酶(CAT和Cu/ZnSOD)活性的影響規(guī)律發(fā)現(xiàn),細(xì)胞實驗中的酶
17、活性抑制現(xiàn)象與分子水平的考察結(jié)果一致,說明了分子水平的酶結(jié)構(gòu)和功能改變也可以從一定程度反映出細(xì)胞中的抗氧化酶的變化程度,驗證了分子毒性實驗的可信度。另外,基于抗氧化酶在細(xì)胞防御系統(tǒng)的重要作用,并且酶結(jié)構(gòu)決定其功能的表達(dá),結(jié)合光譜表征的蛋白構(gòu)象分析,可以判定,F(xiàn)Qs對兩種抗氧化酶結(jié)構(gòu)和功能的影響與其誘發(fā)細(xì)胞的氧化應(yīng)激效應(yīng)機制之間存在密切的聯(lián)系。這為氧化應(yīng)激機制的研究提供了新的思路,有利于疾病的早期診斷、預(yù)防和治療。
論文第五
18、章對各部分的研究結(jié)果進(jìn)行歸納總結(jié),并分析了兩類含氟污染物的轉(zhuǎn)運過程毒性評價方法的優(yōu)勢和不足,對未來的研究方向進(jìn)行了展望。本論文從分子和細(xì)胞兩個層面對兩大類含氟污染物轉(zhuǎn)運過程中的毒性作用機理進(jìn)行了系統(tǒng)的評價,豐富了環(huán)境污染物體內(nèi)轉(zhuǎn)運過程中毒性通路的評價方法,具有很強的參考借鑒價值。通過探討和比較全氟化合物以及氟喹諾酮類藥物同系物間的毒性作用規(guī)律,為認(rèn)識和評估這兩大類含氟污染物的環(huán)境風(fēng)險提供了新的方法和基礎(chǔ)數(shù)據(jù),為相關(guān)疾病的早期診斷、預(yù)防和
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