家蠶性別決定重要因子Masc蛋白的性質(zhì)研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、家蠶(bombyx mori)作為一種鱗翅目昆蟲,可作為模式生物研究其生命活動的調(diào)節(jié)機(jī)制,產(chǎn)出的絲對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要經(jīng)濟(jì)效益,同時(shí)也是開發(fā)新一代生物反應(yīng)器和新型昆蟲產(chǎn)業(yè)的經(jīng)典材料。農(nóng)耕立國,養(yǎng)蠶與種桑一直是我國古代至近代農(nóng)業(yè)的重要組成部分,我國的人工養(yǎng)蠶史已經(jīng)有5000多年,絲綢之路也成為中外經(jīng)濟(jì)、文化交流的重要通道。2003年底,我國率先完成了家蠶基因組框架圖的繪制工作,獲得了大量重要的家蠶基因組信息,這使我國在家蠶功能基因組研究方面

2、處于先進(jìn)和有利地位。通過家蠶這一重要模式生物的功能基因組研究,將促進(jìn)絲綢產(chǎn)業(yè)的發(fā)展、拉動農(nóng)林相關(guān)學(xué)科發(fā)展、促進(jìn)以家蠶為代表的昆蟲產(chǎn)業(yè)開發(fā)、并推進(jìn)生命科學(xué)基礎(chǔ)研究的進(jìn)程。
  而對于家蠶性別的研究無論在生產(chǎn)上還是在害蟲的防治上都具有重要意義。據(jù)研究報(bào)道,由于雄蠶不需要參與產(chǎn)卵過程,它們的產(chǎn)絲量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于雌蠶。因此在生產(chǎn)中調(diào)節(jié)家蠶性別比例,使雄蠶的數(shù)量增加,可以大大提高產(chǎn)絲量,對蠶絲的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。家蠶作為一種模式昆蟲,研究

3、其性別調(diào)控可以通過控制雄蠶的數(shù)量進(jìn)而控制家蠶的繁殖量,繼而達(dá)到鱗翅目害蟲防治的目的。
  從分子生物學(xué)水平研究家蠶性別決定的機(jī)制可以為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供基礎(chǔ)理論和參考。因此,對于家蠶性別決定的基因研究就顯得尤為重要。到目前為止,很多性別相關(guān)的基因被鑒定出來,其中對性別決定起主導(dǎo)作用的基因?yàn)锽mdsx基因。研究Bmdsx基因與其它基因的相互作用對進(jìn)一步探究家蠶的性別調(diào)控具有推動作用。其中,Masc在2014年被發(fā)現(xiàn),該基因可以與家蠶性別調(diào)

4、控初始基因Fem相互作用,調(diào)控著下游Bmdsx基因的選擇性剪切,從而決定家蠶的性別分化。盡管研究人員已經(jīng)知道Masc在家蠶性別決定過程中起著重要作用,然而目前對Masc蛋白本身的性質(zhì)卻報(bào)道甚少。
  因此,我們選取Masc作為研究對象,對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,并克隆包含兩個(gè)CCCH-type鋅指結(jié)構(gòu)和含有部分卷曲結(jié)構(gòu)的domain區(qū)域并進(jìn)行了蛋白的原核表達(dá)及純化;進(jìn)而對該上清活性蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析,并在這兩個(gè)蛋白區(qū)段中選取特異

5、性較強(qiáng)的功能區(qū)制備了多克隆抗體;利用RT-PCR和熒光定量PCR技術(shù)探究Masc在家蠶各組織的表達(dá)特征,同時(shí)對其生殖腺的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測;然后又對其在細(xì)胞及組織的表達(dá)進(jìn)行定位;最后通過IP及質(zhì)譜鑒定探究Masc與其它蛋白的相互作用。獲得的主要結(jié)果如下:
  1、Masc的生物信息學(xué)分析;
  根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,家蠶Masc在NCBI中的登錄號為AB840788.1。經(jīng)分析,Masc的mRNA全長為2075 bp,其中CDS序

6、列長度為1767 bp,5’非翻譯區(qū)(5’UTR)的長度為146 bp,3’非翻譯區(qū)(3’UTR)的長度為162 bp。Masc基因定位于Z染色體上。
  通過生物信息學(xué)分析,結(jié)果顯示其編碼588個(gè)氨基酸;蛋白質(zhì)理論分子量為64.71 kD,等電點(diǎn)為9.69,屬于堿性蛋白。同源性檢索結(jié)果顯示其與大紅斑蝶的同源性最高,但與其它物種的同源性都較低。采用SMART程序進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測,結(jié)果顯示Masc蛋白第48到73和第79到105區(qū)段分

7、別為兩個(gè)含有CCCH-type的鋅指結(jié)構(gòu)域。
  利用家蠶全基因組芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析顯示,該基因的芯片探針號為sw18123;芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)顯示Masc在精巢和卵巢中具有表達(dá)信號,其中精巢的信號值要顯著大于卵巢。
  2、Masc的domain區(qū)的克隆、原核表達(dá)、蛋白純化、二級結(jié)構(gòu)分析及抗體制備;
  取家蠶5齡3天的精巢進(jìn)行研磨并抽提總RNA,將其反轉(zhuǎn)為cDNA作為模板。對Masc的CDS序列的domain區(qū)進(jìn)行序列

8、分析,選取第135 bp到435bp、第900 bp到1305 bp的兩個(gè)區(qū)域分別設(shè)為domain1區(qū)和domain2區(qū),并設(shè)計(jì)引物。以cDNA為模板,利用自己設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR,最終克隆得到兩個(gè)區(qū)域的基因片段,并通過瓊脂糖凝膠電泳及膠回收的方式進(jìn)行片段回收,將回收到的片段雙酶切并用T4連接酶將其與pET-28a的表達(dá)載體相連獲得重組載體,再導(dǎo)入到大腸桿菌感受態(tài)Transetta菌株中,優(yōu)化表達(dá)條件并原核表達(dá)獲得蛋白。
  對d

9、omain1區(qū)表達(dá)的蛋白進(jìn)行凝膠過濾層析的純化及圓二色譜的測定,圓二色譜法分析可得Masc的domain1區(qū)表達(dá)的蛋白含有豐富的β-折疊的結(jié)構(gòu),這與其具有鋅指結(jié)構(gòu)的結(jié)果相符??紤]到domain2區(qū)段的特異性較好,故domain2區(qū)表達(dá)的蛋白送入公司制備抗體,獲得了0.62mg/mL的多克隆抗體,效價(jià)為1:500000,通過western blotting的檢測結(jié)果顯示該抗體的單一性良好,可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
  3、Masc在RNA

10、及蛋白水平的組織表達(dá)特征分析;
  采用RT-PCR、熒光定量PCR進(jìn)行Masc各組織間表達(dá)水平的檢測,結(jié)果顯示Masc在家蠶5齡3天的生殖腺中表達(dá),其中在精巢中高量表達(dá),而在卵巢中也能檢測到其表達(dá),但表達(dá)量較低。生殖腺的蛋白定量結(jié)果也顯示,Masc蛋白在生殖腺中的精巢表達(dá)量較高,這個(gè)結(jié)果與RNA水平的表達(dá)結(jié)果一致。這些結(jié)果說明Masc在生殖腺中可能發(fā)揮著重要作用。
  4、Masc在細(xì)胞及組織的表達(dá)定位分析;
  為

11、了進(jìn)一步研究Masc的性質(zhì),本論文進(jìn)行了Masc的表達(dá)定位研究。首先,將Masc的全長CDS進(jìn)行克隆并在N端加入Myc融合標(biāo)簽,然后連接到真核表達(dá)載體1180[Hrs1000-BmAct4-LUC-Ser1PA]上,獲得重組真核表達(dá)載體1180[Hrs1000-BmAct4-Myc-Masc-LUC-Ser1PA],轉(zhuǎn)染BmE細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá),采用Myc標(biāo)簽抗體進(jìn)行雜交。結(jié)果顯示,Masc在BmE細(xì)胞中主要定位于細(xì)胞質(zhì)。為了進(jìn)一步確認(rèn)亞細(xì)

12、胞定位結(jié)果,我們采用Masc抗體進(jìn)行雜交,結(jié)果顯示Masc蛋白在BmE的細(xì)胞質(zhì)中同樣具有很強(qiáng)的信號。
  然后,我們進(jìn)行了Masc蛋白在生殖腺組織的表達(dá)情況研究。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Masc主要在結(jié)締組織層、精原細(xì)胞、生精囊和精子束中均有表達(dá)。其中,該蛋白在精子束中主要定位在細(xì)胞核;而在生精囊中主要定位在細(xì)胞質(zhì);在結(jié)締組織層中主要定位在細(xì)胞質(zhì)。這些結(jié)果暗示Masc在精巢中可能發(fā)揮著多種功能。
  5、Masc與其它蛋白的相

13、互作用分析;
  為了獲得新的與Masc相互作用的蛋白,本論文進(jìn)行了Masc的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。Masc-IP實(shí)驗(yàn)及質(zhì)譜鑒定的結(jié)果顯示,一共鑒定了185種蛋白,分別在66個(gè)蛋白組中。其中與家蠶性別決定相關(guān)的蛋白有2個(gè),分別是Ago3和Siwi蛋白。這些結(jié)果暗示Masc蛋白可能同參與ping-pong機(jī)制并含有Piwi功能域的Ago3和Siwi蛋白結(jié)合,參與性別調(diào)控的過程。下一步我們將通過Co-IP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Masc與Ago3及Siwi相

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