上師大食品論文采用生物發(fā)酵技術(shù)制備低蛋白質(zhì)大米實(shí)驗(yàn)研究

1、<p><b>　　摘要</b></p><p>　　蛋白質(zhì)是生物體重要的組成成分,蛋白質(zhì)具有重要的生理功能，是維持人體健康不可缺少的營(yíng)養(yǎng)素,同時(shí)也是維持生命最重要的營(yíng)養(yǎng)素。蛋白質(zhì)的含量占人體總固體量的45%。正常人在日常飲食中, 應(yīng)該攝入足夠的蛋白質(zhì), 來(lái)維持人體健康。但是對(duì)于患有腎臟病群體而言, 則需要低蛋白飲食, 以限制其疾病的發(fā)展。本課題以勤禾源益腎米為原料，利用生物發(fā)酵技

2、術(shù)制備低蛋白質(zhì)大米，以乳酸菌和酸性蛋白酶的復(fù)配，山梨糖醇作為營(yíng)養(yǎng)劑配成發(fā)酵溶液，密封37℃發(fā)酵24小時(shí)，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，最終測(cè)定結(jié)果顯示當(dāng)乳酸菌和酸性蛋白酶濃度都為0.05%，山梨糖醇濃度為0.625%，pH為4.0左右時(shí)，蛋白質(zhì)溶解量最多，最終測(cè)定結(jié)果蛋白質(zhì)下降了22.49%。</p><p>　　關(guān)鍵詞：低蛋白米；乳酸菌；酸性蛋白酶；發(fā)酵；山梨糖醇</p><p><

3、;b>　　Abstract</b></p><p>　　Protein is an important component of the organism, it has important physiological functions and it is not only indispensable nutrients to maintain human health, but also t

4、he most important nutrients to sustain life. Protein content accounts for 45% of the total solids of the human body. Protein should be adequate intake to maintain human health in the normal diet .However，to pat

5、ients with kidney disease, the low-protein diet is required to limit the development of their disease. This topic used </p><p>　　Keywords: Low protein rice; Lactic acid bacteria; Acid proteae; Fermentat

6、ion; Sorbitol</p><p><b>　　目錄</b></p><p><b>　　誠(chéng)信聲明I</b></p><p>　　上海師范大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）選題登記表III</p><p>　　上海師范大學(xué)畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）指導(dǎo)記錄表IV</p><p>&

7、lt;b>　　摘要V</b></p><p>　　AbstractVI</p><p><b>　　1 前言1</b></p><p><b>　　2 材料和方法3</b></p><p><b>　　2.1 材料3</b></p>&

8、lt;p>　　2.2 實(shí)驗(yàn)原理3</p><p>　　2.3試劑與器材4</p><p>　　（1）考馬斯亮藍(lán)試劑：4</p><p><b>　　2.4實(shí)驗(yàn)過(guò)程4</b></p><p>　　2.4.1 碳源（山梨糖醇）加入量對(duì)降低蛋白質(zhì)的含量比較試驗(yàn)4</p><p>　　2.

9、4.2 不同乳酸菌濃度對(duì)降低蛋白質(zhì)的含量比較試驗(yàn)5</p><p>　　2.4.3不同酸性蛋白酶濃度對(duì)降低蛋白質(zhì)的含量比較試驗(yàn)6</p><p><b>　　3結(jié)果與分析7</b></p><p>　　3.1 山梨糖醇的加入量選擇7</p><p>　　3.2 乳酸菌濃度的選擇7</p><

10、p>　　3.3酸性蛋白酶濃度的選擇8</p><p>　　3.4綜合所得最適宜的配方8</p><p><b>　　3.5結(jié)果討論8</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)10</b></p><p><b>　　1前言</b></p><

11、;p>　　蛋白質(zhì)和生命活動(dòng)有著十分密切的關(guān)系,蛋白質(zhì)提供人體的基本需求。臨床研究表明,對(duì)于腎病患者而言,控制蛋白質(zhì)的攝入能控制慢性腎臟疾病的惡化。患有腎臟疾病的人,低蛋白或極低蛋白飲食都?jí)蚰苁沟鞍啄虺潭冉档筒⑶沂鼓I小球?yàn)V過(guò)功能的下降速度減慢,可以有效推遲尿毒癥出現(xiàn)的時(shí)機(jī)并緩解它的臨床癥狀, 降低終末期腎臟病的相對(duì)危險(xiǎn)度 ,但是如果能夠從主食中減少蛋白質(zhì)的攝入量,那么將能極大的限制飲食中總的蛋白質(zhì)的攝入量。因此如何開(kāi)發(fā)一種低蛋白主食

12、的研究具有重要的研究意義。</p><p>　　目前市售的低蛋白質(zhì)大米有中農(nóng)益食有機(jī)低蛋白大米，米“LGC一1”，“康盾1號(hào)”低蛋白功能大米，“w3660”，日本越后低蛋白米，瑞盛低蛋白營(yíng)養(yǎng)米還有上海師范大學(xué)厭煩的勤禾源益腎米等。</p><p>　　從目前國(guó)內(nèi)研究情況看,大米蛋白提取方法主要有堿法、酶法、堿酶兩步法等,研究目標(biāo)是盡可能提高產(chǎn)品中蛋白含量和得率, 以提高產(chǎn)品附加值。堿法提取

13、大米蛋白原理是利用大米蛋白中80％以上的蛋白為堿溶性谷蛋白，堿法大米中與大米蛋白結(jié)合的大米淀粉的緊密結(jié)構(gòu)變得疏松，同時(shí)堿液對(duì)蛋白分子的次級(jí)鍵特別是氫鍵有破壞作用，并可使某些極性基團(tuán)發(fā)生解離，使蛋白質(zhì)分子的表面具有相同的電荷，從而對(duì)蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生增溶作用，促進(jìn)淀粉與蛋白質(zhì)分離。事實(shí)上，稀堿對(duì)大米蛋白的作用很復(fù)雜，如pH值、溫度、時(shí)間、料液比等因素對(duì)蛋白質(zhì)的影響都會(huì)引起提取體系及提取性質(zhì)的改變。實(shí)驗(yàn)表明，pH值為11.0，溫度20℃ ，振蕩

14、30 min時(shí)，谷蛋白的提取率可以達(dá)到93.2％ ；谷蛋白在pH值為11.8時(shí)可得到98％的提取回收率 ，pH值低于10時(shí)谷蛋白的堿溶性急驟下降 。大米蛋白的堿法提取只是提取了大米蛋白中的堿溶性谷蛋白，而水溶性白蛋白、鹽溶性球蛋白、醇溶蛋白都留在殘?jiān)欣速M(fèi)了，并且不利于下一步利用渣滓生產(chǎn)淀粉?，F(xiàn)利用酶水解蛋白方法研究較多。酶法提取主要是用蛋白酶和淀粉酶等將大米蛋白分子降解為可溶性或淀粉水解后再抽提出來(lái)。其主要工藝流程</p>

15、<p>　　近60年來(lái),世界各國(guó)生產(chǎn)大米淀粉和蛋白的方法一直沒(méi)有很大的改進(jìn),基本是用堿浸泡來(lái)分解其中含有的蛋白質(zhì)和淀粉。這種方法一般會(huì)降低所提取的蛋白質(zhì)和淀粉品質(zhì),同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生鹽和其它有害物質(zhì)。目前,美國(guó)科學(xué)家開(kāi)發(fā)出一種價(jià)效比更高新方法,即利用一種特別均質(zhì)器所產(chǎn)生高壓, 對(duì)大米中淀粉和蛋白質(zhì)聚成塊進(jìn)行物理分解大米只需一次性通過(guò)這種設(shè)備,即可產(chǎn)生水狀顆粒均勻淀粉和蛋白質(zhì)微分子,然后通過(guò)基于密度的傳統(tǒng)分離工藝對(duì)其中淀粉和蛋白質(zhì)

16、進(jìn)行分離。這種新工藝可保留所提取大米蛋白質(zhì)和淀粉原有品質(zhì), 生產(chǎn)出蛋白質(zhì)和淀粉與傳統(tǒng)加工方法相比,具有更好完整性和功能性美國(guó)科學(xué)家認(rèn)為, 這種新方法有可能對(duì)大米淀粉和蛋白質(zhì)生產(chǎn)帶來(lái)革命性變化；同時(shí), 美國(guó)科學(xué)家正在研究采用同樣工藝從米糠中提取蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及淀粉。</p><p>　　Anderson等采用經(jīng)膠體磨和均質(zhì),通過(guò)破碎結(jié)構(gòu),使蛋白溶出而進(jìn)行提取大米蛋白方法。據(jù)報(bào)道,經(jīng)微粉碎和均質(zhì)后,蛋白質(zhì)溶出濃度比單純

17、水溶液取率提高75 %,原料經(jīng)物理方法處理,其蛋白質(zhì)溶出濃度可提高18.7%,且磨漿和均質(zhì)可使溶出組分分子量差別很大,所以利用物理方法增進(jìn)蛋白提取率也是可行的。</p><p>　　Tang對(duì)經(jīng)熱穩(wěn)定化蛋白質(zhì)提取進(jìn)行系統(tǒng)研究,認(rèn)為用物理方法并結(jié)合酶水解技術(shù)提取蛋白質(zhì)效果明顯。當(dāng)反復(fù)凍融、超聲波、高速剪切和高壓等方法單獨(dú)使用時(shí)只能分別提取12 %、15%、16 %、11% 大米蛋白,而經(jīng)超聲波處理后再用淀粉酶水解,

18、可提取3.9%蛋白；若用蛋白酶處理,則可提取5.78% 蛋白；高壓處理后同時(shí)使用淀粉酶和蛋白酶,則可提取66.6% 蛋白,應(yīng)用效果高于纖維素酶,所以首先采用物理方法解除對(duì)蛋白質(zhì)束縛非常有利于蛋白質(zhì)提取。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)選用2013年上海師范大學(xué)研發(fā)，崇明生產(chǎn)大米為原料，通過(guò)查閱文獻(xiàn)，篩選出一些可能對(duì)去除大米蛋白質(zhì)效果比較好的蛋白酶，采用生物發(fā)酵技術(shù)，制備低蛋白質(zhì)大米。多次復(fù)配篩選后選取最佳乳酸菌和酸性

19、蛋白酶的復(fù)配濃度，采用食品添加劑中的甜味劑山梨糖醇作為發(fā)酵供能的糖來(lái)源，37℃發(fā)酵箱中密封發(fā)酵原料大米24h，制備出低蛋白質(zhì)大米，以考馬斯亮藍(lán)法為依據(jù)用分光光度計(jì)測(cè)出制備后大米的蛋白質(zhì)含量，得出并討論數(shù)據(jù)結(jié)果。</p><p><b>　　2材料和方法</b></p><p><b>　　2.1 材料</b></p><p&g

20、t;　　標(biāo)準(zhǔn)稻米：2013年生產(chǎn)稻米（上海師范大學(xué)研發(fā)，崇明生產(chǎn)大米）</p><p>　　菌種：市面所售食用乳酸菌</p><p>　　蛋白酶：酸性蛋白酶，胃蛋白酶</p><p>　　碳能：食品添加劑山梨糖醇</p><p><b>　　2.2 實(shí)驗(yàn)原理</b></p><p>　　考馬斯亮藍(lán)

21、(Coomassie Brilliant Blue)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，是利用蛋白質(zhì)―染料結(jié)合的原理，定量的測(cè)定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。這種蛋白質(zhì)測(cè)定法具有超過(guò)其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定法。 </p><p>　　考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465nm變?yōu)?595nm，溶液

22、的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。通過(guò)測(cè)定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。研究發(fā)現(xiàn)，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。</p><p><b>　　2.3試劑與器材</b></p><p>　?。?）考馬斯亮藍(lán)試劑：</p><p>　　準(zhǔn)確稱取考馬斯亮藍(lán)G―250 100mg溶于50mL 95

23、%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，用蒸餾水稀釋定容至1000mL，貯于棕色瓶中，常溫下可保存一個(gè)月。</p><p>　?。?）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：</p><p>　　純牛血清血蛋白，根據(jù)其純度和0.15mol/L 的NaCl溶液配制成100ug/ml蛋白溶液。</p><p>　?。?）器材：分光光度計(jì)，研缽，粉碎機(jī)，100目網(wǎng)篩，恒溫發(fā)酵箱，烘箱，pH計(jì)，燒杯

24、，移液槍，離心管，離心機(jī)，量筒</p><p><b>　　（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制</b></p><p>　　取6支試管，按下表加入各試劑。</p><p>　　加入考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑后，搖勻，放置2min后，在595nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定，記錄A595。以各管相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量（mg）為橫坐標(biāo)、A595為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。</p

25、><p><b>　　2.4實(shí)驗(yàn)過(guò)程</b></p><p>　　2.4.1 碳源（山梨糖醇）加入量對(duì)降低蛋白質(zhì)的含量比較試驗(yàn)</p><p>　　準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)大米200g三份，分別放入容量為250ml的發(fā)酵瓶中，標(biāo)記為發(fā)酵瓶1，發(fā)酵瓶2，發(fā)酵瓶3。</p><p>　　配制發(fā)酵液：準(zhǔn)確稱量0.1g乳酸菌，充分溶解于100m

26、l蒸餾水中，配制成0.10%的乳酸菌溶液，同樣的方法配制濃度為0.10%的酸性蛋白酶溶液。用100ml量筒分別量取80ml所配置的乳酸菌溶液和酸性蛋白酶溶液，充分混勻于250ml的燒杯中，得到0.05%乳酸菌和0.05%酸性蛋白酶的混合溶液，加入0.5g山梨糖醇于混合液中作為發(fā)酵的碳能量來(lái)源，充分?jǐn)嚢柚敝辆|(zhì)。根據(jù)所查閱的資料得知，最佳發(fā)酵pH值為4.0左右。用移液槍緩慢加入L-乳酸調(diào)節(jié)pH值為4.0，期間用pH計(jì)測(cè)量pH值。</

27、p><p>　　將配置好的溶液加入發(fā)酵瓶1中，充分混勻，密封，在恒溫37℃的發(fā)酵箱中發(fā)酵24h后拿出，將發(fā)酵瓶中的大米用蒸餾水反復(fù)清洗15min，洗清溶解出的蛋白質(zhì)和發(fā)酵殘余液，清洗時(shí)注意不要破壞大米原來(lái)的質(zhì)構(gòu)。將清洗后的大米倒入小孔網(wǎng)袋中，放置于40℃的恒溫烘箱中烘干4h。取出后用60-100目的粉碎機(jī)粉碎成大米粉，用100目的網(wǎng)篩篩出極細(xì)的大米粉20g左右備用，標(biāo)注為大米粉A。同樣的方法將標(biāo)準(zhǔn)大米粉制成極細(xì)的米粉

28、約20g備用。</p><p>　　用分析天平稱取0.20g標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照大米粉兩份和0.20g大米粉A四份分別于6支離心管中，離心管上標(biāo)注為對(duì)照1，A1，A2，A3，A4，對(duì)照2。分別加入10ml蒸餾水，充分混勻，于70℃恒溫烘箱中放置1h，取出后室溫冷卻，轉(zhuǎn)速為5000r/min的離心機(jī)中離心10min。取上清液0.1ml于10ml試管中，用移液槍加入0.9ml蒸餾水和5mlG-250考馬斯亮藍(lán)溶液混合，倒入比色皿

29、中，靜置2min后用分光光度計(jì)在595nm下分別測(cè)量吸光度,重復(fù)三次，取平均值。（步驟1）</p><p>　　重復(fù)步驟1，將發(fā)酵瓶2中山梨糖醇加入量改為1.0g，發(fā)酵瓶3中山梨糖醇加入量改為1.5g，測(cè)量完清洗實(shí)驗(yàn)用品.（測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表1）</p><p>　　表1碳源加入量對(duì)降低蛋白質(zhì)的含量效果</p><p>　　根據(jù)表1得知山梨糖醇加入量為1.0g時(shí)對(duì)降低蛋白

30、質(zhì)含量的效果最佳，由此再篩選不同乳酸菌濃度對(duì)降低蛋白質(zhì)含量效果的影響 。</p><p>　　2.4.2 不同乳酸菌濃度對(duì)降低蛋白質(zhì)的含量比較試驗(yàn)</p><p>　　配制發(fā)酵液時(shí)山梨糖醇的加入量都為1.0g，發(fā)酵瓶1中酸性蛋白酶濃度為0.05%，乳酸菌濃度為0.05%；發(fā)酵瓶2中酸性蛋白酶濃度為0.05%，乳酸菌濃度為0.03%；發(fā)酵瓶3中酸性蛋白酶濃度為0.05%，乳酸菌濃度為0.01

31、%，重復(fù)步驟1（測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表2）</p><p>　　表2不同乳酸菌濃度對(duì)降低蛋白質(zhì)的含量效果</p><p>　?。ㄉ嚼嫣谴?.0g，酸性蛋白酶濃度0.05%）</p><p>　　2.4.3不同酸性蛋白酶濃度對(duì)降低蛋白質(zhì)的含量比較試驗(yàn)</p><p>　　乳酸菌濃度都為0.05%：配制發(fā)酵液時(shí)山梨糖醇的加入量為1.0g，發(fā)酵瓶1中乳酸菌濃

32、度為0.05%，酸性蛋白酶濃度為0.05%；發(fā)酵瓶2中乳酸菌濃度為0.05%，酸性蛋白酶濃度為0.03%；發(fā)酵瓶3中乳酸菌濃度為0.05%，酸性蛋白酶濃度為0.01%，重復(fù)步驟1（測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表3）</p><p>　　表3不同酸性蛋白酶濃度對(duì)降低蛋白質(zhì)的含量效果</p><p>　?。ㄉ嚼嫣谴?.0g，乳酸菌濃度濃度0.05%）</p><p>　　乳酸菌濃度都為0

33、.03%：配制發(fā)酵液時(shí)山梨糖醇的加入量為1.0g，發(fā)酵瓶1中乳酸菌濃度為0.03%，酸性蛋白酶濃度為0.05%；發(fā)酵瓶2中乳酸菌濃度為0.03%，酸性蛋白酶濃度為0.03%；發(fā)酵瓶3中乳酸菌濃度為0.03%，酸性蛋白酶濃度為0.01%，重復(fù)步驟1（測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表4）</p><p>　　表4不同酸性蛋白酶濃度對(duì)降低蛋白質(zhì)的含量效果</p><p>　?。ㄉ嚼嫣谴?.0g，乳酸菌濃度濃度0.0

34、3%）</p><p>　　乳酸菌濃度都為0.01%：配制發(fā)酵液時(shí)山梨糖醇的加入量為1.0g，發(fā)酵瓶1中乳酸菌濃度為0.01%，酸性蛋白酶濃度為0.05%；發(fā)酵瓶2中乳酸菌濃度為0.01%，酸性蛋白酶濃度為0.03%；發(fā)酵瓶3中乳酸菌濃度為0.01%，酸性蛋白酶濃度為0.01%，重復(fù)步驟1（測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表5）</p><p>　　表5不同酸性蛋白酶濃度對(duì)降低蛋白質(zhì)的含量效果</p>

35、;<p>　　（山梨糖醇1.0g，乳酸菌濃度濃度0.01%）</p><p><b>　　3結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1 山梨糖醇的加入量選擇</p><p>　　根據(jù)表1中加入不同量的山梨糖醇后測(cè)得的吸光度值得出山梨糖醇在作為發(fā)酵供能來(lái)源時(shí)的加入量為1.0g時(shí)，對(duì)發(fā)酵的促進(jìn)作用最大，蛋白質(zhì)降低效果最明顯，大于或

36、者小于這個(gè)數(shù)值時(shí)效果都不是很理想。</p><p>　　3.2 乳酸菌濃度的選擇</p><p>　　根據(jù)表2得出結(jié)論：當(dāng)酸性蛋白酶濃度為0.05%，乳酸菌濃度也為0.05%時(shí)，大米蛋白降低效果最明顯</p><p>　　3.3酸性蛋白酶濃度的選擇</p><p>　　結(jié)合表3，表4，表5中的數(shù)據(jù)結(jié)果可以看出，當(dāng)酸性蛋白酶濃度為0.03%和0

37、.01%，乳酸菌濃度也分別做三個(gè)稀釋度時(shí)，對(duì)大米蛋白的降低效果都不是很明顯。</p><p>　　3.4綜合所得最適宜的配方</p><p>　　綜合上述結(jié)論得知當(dāng)山梨糖醇加入量為1.0g，乳酸菌濃度和酸性蛋白酶濃度都為0.05%時(shí)對(duì)大米蛋白降低效果最明顯。根據(jù)農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(上海）對(duì)實(shí)驗(yàn)所制得降低最多大米蛋白的產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果報(bào)告顯示（表6），相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照大米蛋白質(zhì)含量，

38、本實(shí)驗(yàn)所研制的低蛋白大米蛋白質(zhì)含量在原基礎(chǔ)上降低了22.49%。絕大部分米的顆粒完整，透明度略有降低，煮熟后味道與普通大米區(qū)別不大，口感基本無(wú)變化。改良后的大米除蛋白質(zhì)含量有所降低以外脂肪含量也有所降低，而碳水化合物，能量和鈉的含量有所升高。</p><p><b>　　表6檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告</b></p><p><b>　　3.5結(jié)果討論</b>

39、</p><p>　　用生物發(fā)酵技術(shù)制備低蛋白大米，較為適宜的工藝參數(shù)是發(fā)酵溫度37℃，酸性蛋白酶添加量為0.05%，乳酸菌添加量為0.05%，山梨糖醇添加量為1g，pH為4.0，發(fā)酵時(shí)間為24h，蒸餾水清洗15min，40℃恒溫烘箱干燥4h，能得到具有優(yōu)越的外觀和口感，顆粒飽滿，顏色均一，具有米飯香氣，與粳米非常接近，同時(shí)與粳米相比，其蛋白質(zhì)含量非常低，只有4.86%左右。在滿足外觀和口感的同時(shí)，也能滿足慢性腎

40、臟病患者限制蛋白質(zhì)攝入的需求。本次試驗(yàn)雖然大米蛋白有所降低，但是由于實(shí)驗(yàn)條件和時(shí)間限制，所得的實(shí)驗(yàn)效果還不是很顯著，相對(duì)于日本所研發(fā)的低蛋白大米蛋白質(zhì)含量還有一定的差距，想要得到理想的效果還需進(jìn)一步改進(jìn)試驗(yàn)方案，做進(jìn)一步研究。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 　湛貽璞.低蛋白飲食對(duì)延緩慢性腎損害進(jìn)展的意義-MDRD 試驗(yàn)[J]

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