基于microRNA表達譜的變化探討活血消異方治療子宮內膜異位癥療效機制研究.pdf

1、研究背景:
　　活血消異方是導師治療氣滯血瘀型子宮內膜異位癥的經驗方。本研究從文獻梳理、療效觀察、機理探討3個方面對活血消異方組方的合理性和科學性進行了探討，期望在現(xiàn)有的西藥及手術治療方法的基礎上，尋求有效的預防和治療手段，使更多內異癥患者受益。
　　研究目的:
　　圍繞研究目標，本項課題從中醫(yī)文獻研究、臨床觀察及microRNA基因表達，以及動物實驗驗證三個部分展開研究。
　　1.文獻研究:本論文結合古代文獻分

2、析與數(shù)據挖掘技術，分析古代婦科文獻中癥瘕病治療方藥的配伍應用規(guī)律，為活血消異方治療子宮內膜異位癥治法治則、處方依據提供理論基礎。
　　2.臨床研究:觀察活血消異方治療卵巢型子宮內膜異位癥的臨床療效，以及治療前后子宮內膜異位癥患者血清microRNA基因表達譜的變化，以臨床療效為出發(fā)點，從基因層面探討活血消異方治療子宮內膜異位癥可能的生物學機制。
　　3.實驗研究:通過建立實驗性大鼠子宮內膜異位癥模型，觀察子宮內膜異位癥大鼠異

3、位病灶體積、組織學變化，血清和腹腔液相關炎性因子以及相關蛋白及基因表達的影響，探討活血消異方治療子宮內膜異位癥可能的分子機制。
　　研究方法:
　　1.文獻研究:檢索《中華醫(yī)典》收錄的古代婦科醫(yī)著中治療癥瘕的方藥信息，錄入中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng)，采用軟件集成的改進互信息法、復雜系統(tǒng)熵聚類、無監(jiān)督的熵層次聚類等數(shù)據挖掘方法，分析處方用藥規(guī)律。
　　2.臨床研究:選取醫(yī)院就診的一定時期內，符合納入標準，不符合排除標準的子宮內膜異

4、位癥患者作為研究對象，活血消異方加減治療6個月，觀察治療前后痛經、月經量改變、慢性盆腔痛等臨床癥狀、體征的改善情況，血清CA125、CA199表達變化情況以及安全性指標變化情況、不良反應情況。并于生物樣本庫中隨機選取5例治療有效的患者，提取治療前、后靜脈血分離的單核淋巴細胞，提取總RNA，行Real-time qPCR陣列基因芯片做miRNA檢測，對差異表達的基因進行生物信息學分析。
　　3.實驗研究:選用60日齡成熟SD雌性大鼠

5、，采用自體組織移植法造模，造模成功后隨機分為活血消異方高、中、低劑量組、達菲林組、模型組、假手術組、空白對照組，共7組，每組8只，給藥治療3周。觀察異位病灶體積、組織學變化情況;血清及腹腔液IL-2、IL-6、IL-1β表達變化情況;NFKB，PIK3R3，RAS基因表達情況。
　　研究結果:
　　（一）文獻研究:
　　1.本研究共收集治療婦科癥瘕方劑108首，涉及中藥188味，用藥頻次在8次以上的前15位分別是當歸、

6、桂心、赤芍、熟地、大黃、莪術、川芎、三棱、桃仁、炙甘草、干姜、延胡索、牛膝、木香、牡丹皮。其中，以養(yǎng)血、活血、破血、溫陽、理氣、通瘀藥物頻數(shù)較高。
　　2.頻次前10位的藥物組合分別是“當歸，桂心”“赤芍，當歸”“川芎，當歸”“延胡索，當歸”“三棱，莪術”“莪術，當歸”“熟地黃，當歸”“川芎，桂心”、“延胡索，桂心”“赤芍，桂心”“牛膝，當歸”“桃仁，當歸”“莪術，青皮”，較為常見的組合是以當歸為核心:與桂心組合體現(xiàn)了溫通之法，與

7、赤芍、熟地組合體現(xiàn)了養(yǎng)血之法，與三棱、莪術組合體現(xiàn)了破瘀之法，與青皮、延胡索、川芎組合體現(xiàn)了行氣之法，與桃仁、牛膝組合體現(xiàn)了逐瘀之法。
　　3.網絡展示圖形式發(fā)現(xiàn)，這些組合的配伍是以活血化瘀法為主，活血、養(yǎng)血、行氣、溫經、通瘀是治療癥瘕較為常用的治法。
　?。ǘ┡R床觀察:
　　1.活血消異方治療子宮內膜異位癥患者102例，療程3～6個月，其臨床總有效率為85.30％。
　　2.不同治療時間點卵巢囊腫縮減情況差異

8、有統(tǒng)計學意義(F=17.055，p＜0.001)，治療3個月和治療6個月后卵巢囊腫均較治療前縮小，但前3個月治療期內囊腫消減的趨勢更快。
　　3.隨治療時間的延長，痛經程度明顯緩解，痛經持續(xù)時間明顯縮短，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);治療6個月期間，患者的中醫(yī)癥狀均有緩解，各個療程節(jié)點與治療前比較，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　4.102例患者中月經量多患者31例，其月經積分在不同時間點測量差異有統(tǒng)計學差異(F

9、=19.648，p＜0.01);服藥6個月經周期后較治療前月經量明顯減少;服藥4個月經周期后月經量多積分不斷減少至正常水平。102例患者中月經量少患者11例，服藥6個月經周期后較治療前月經量有改善，但不同時間點測量之間差異無統(tǒng)計學差異(F=1.084，p=0.382)。
　　5.治療6個月后CA125較治療前總體趨勢降低(F=7.101，P=0.024);CA199較治療前總體趨勢降低(F=10.008，P=0.008)，差異有統(tǒng)

10、計學意義(p＜0.05)。
　　6.在數(shù)據完整的78例患者中，治療前血清TNF-α異常的有2例(2.5％)，治療6個月后后血清TNF-α異常1例，差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。
　　7.本研究中納入的患者，在服藥3個月經周期和服藥6個月經周期肝腎功指標均未見異常，差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，心電圖，血尿常規(guī)均未見明顯異常。
　?。ㄈ﹎icroRNA表達譜芯片表達:
　　Real-time qPCR陣列

11、基因芯片檢測，共篩選出5個qRT-PCR驗證的有差異表達的microRNA，其中上調的基因表達有miR-202-3p，miR-9-5p，miR-155-5p;下調的基因表達有miR-216a-5p，miR-518a-5p。涉及的通路集中在催乳素信號通路，Ras信號通路， Rap1信號通路，Hippo信號通路，雌激素信號通路，神經營養(yǎng)因子信號通路，ErbB信號通路，甲狀腺激素信號通路，磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)，MAPK信號通路，TGF-β信號通

12、路，F(xiàn)oxO信號通路，癌癥途徑等信號通路上。這些富集的通路主要與細胞黏附、遷移以及部分細胞凋亡功能相關。
　　（四）動物實驗:
　　1.子宮內膜異位癥模型大鼠在給藥3周后，中藥高劑量、中劑量組和達菲林組異位病灶體積與給藥前相比明顯變小或者消失，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);
　　2.HE染色后，采用半定量組織學分類方法確定子宮內膜異位癥評分發(fā)現(xiàn):達菲林組和中藥高劑量組的子宮內膜異位癥評分明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學

13、意義(p＜0.05)。中藥低劑量組和中藥中劑量組在降低子宮內膜異位癥評分方面優(yōu)勢不明顯(p＞0.05)。
　　3.Real-time PCR對目的基因檢測后發(fā)現(xiàn):正常組與模型組相比，模型組的NFKB，PIK3R3，RAS基因表達量顯著增高，差異有顯著性（正常組2-△△Ct＞1）;治療后，中藥高劑量組與模型組相比，NFKB，PIK3R3，RAS基因表達量顯著降調，差異有顯著性（2-△△Ct＞1）;中藥中劑量組與模型組相比，NFKB，

14、PIK3R3基因表達量顯著降調，差異有顯著性(2-△Ct＞1);RAS基因表達量降調，但差異無顯著性（2-△△Ct＜1）;治療后，中藥低劑量組與模型組相比，NFKB，PIK3R3，RAS基因表達量顯著降調，但差異無顯著性(2-△△Ct＜1)。
　　4.采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附技術檢測相關細胞因子濃度:模型組異位病灶血清和腹腔液IL-2、IL-6、IL-1β的濃度顯著高于正常組、假手術組和治療組(p＜0.05)。經活血消異方高、中

15、劑量組和達菲林組治療的子宮內膜異位癥大鼠血清和腹腔液中IL-2、IL-6、IL-1β的濃度明顯降低(p＜0.05)。
　　研究結論:
　　活血消異方是基于古代文獻關于婦科癥瘕類疾病的認識，遵循中醫(yī)立法原則和處方規(guī)律，在繼承和發(fā)展名老中醫(yī)經驗的基礎上制訂的治療子宮內膜異位癥的有效方劑。臨床觀察表明，活血消異方治療子宮內膜異位癥在消減包塊、緩解痛經、改善月經、抑制病情方面具有良好的療效，且安全性好，無明顯不良反應。動物實驗研究表