硫鏈絲菌肽治療子宮內膜異位癥的療效觀察及機制研究.pdf

1、子宮內膜異位癥（endometriosis，EMS，簡稱內異癥）是子宮內膜組織種植和生長在子宮腔以外的一種慢性、雌激素依賴性的疾病。作為最為常見的婦科疾病之一，內異癥在育齡期女性中的發(fā)病率為10％～15％，以慢性盆腔痛、痛經、不孕為主要癥狀。高達35％～50％的慢性盆腔痛和不孕患者診斷為內異癥，發(fā)病率呈上升趨勢。大量的證據表明雌激素在異位病灶的建立和發(fā)展中起著重要的作用。然而，其發(fā)病機制尚不明確。
　　主要的學說和發(fā)病因素包括:(

2、1)異位種植學說，包括經血逆流學說和淋巴和靜脈學說，經血通過輸卵管進入盆腔，76％～90％的生育期女性中存在經血逆流的情況，但其中只有很少一部分女性發(fā)生內異癥。此學說不能解釋青春期、新生兒的內異癥。(2)體腔上皮化生學說及誘導學說，假設內異癥是由內臟和盆腔腹膜的間皮細胞化生而來，卵巢激素和免疫因子可刺激體腔上皮分化而來的組織和未分化的腹腔組織向內膜樣組織轉化。但由于青春期少女的雌激素水平是不高的，因此該學說只可解釋部分的青春期的內異癥;

3、(3)苗勒氏管發(fā)育異常學說;(4)遺傳因素，此學說基于內異癥有一定的家族聚集性，已發(fā)現異位組織中存在染色體異常和表觀遺傳修飾的異常;(5)氧化應激和炎癥因素，脂蛋白的過氧化與內異癥的病理有關，導致異位組織的DNA損傷。過量的活性氧也會消除抗氧化物，從而不能清除異位內膜;異位組織產生大量的巨噬細胞、前列腺素、細胞因子和趨化因子等;(6)其他學說及因素，例如干細胞學說和異位內膜細胞凋亡抑制等。本病病因復雜，以上學說均不能完全闡釋內異癥的發(fā)病

4、機制。
　　內異癥與癌癥之間的組織學聯(lián)系的假說最早在1925年被提出。Sampson基于在顯微鏡下觀察組織，提出了上皮性卵巢癌起源于內異癥，并描述了診斷內異癥相關的卵巢癌的診斷標準，包括(1)內異癥鄰近腫瘤發(fā)生的部位的證據;(2)排除其他來源的腫瘤轉移;(3)子宮內膜上皮細胞及其周圍的特征性的腔上皮腺體樣的組織的存在。Scottet在1953年補充了第四條診斷標準，腫瘤組織中，存在內異癥的良性改變向惡性改變轉變的組織學證據。如今，

5、這四條標準仍然被用來定義內異癥相關的惡性腫瘤(endometriosis-associated malignancy，EAM)。內異癥是內異癥相關的卵巢癌的癌前病變的一個有力的支持是，在異位的內膜組織中發(fā)現了很多致癌基因與抑癌基因的突變。大量證據表明內異癥與癌癥之間存在聯(lián)系，特別是透明細胞性卵巢癌。因此，異位內膜中的腫瘤抑制因子和致癌因子表達的改變或許會導致異位組織的異常增殖。內異癥被認為是遺傳學的不穩(wěn)定，在內異癥和卵巢癌中都能發(fā)現腫瘤

6、抑制因子的基因突變，如PTEN，p53，bcl，ARID1A和TP53。越來越多的證據表明異常的表觀遺傳修飾在內異癥的發(fā)病機制中發(fā)揮重要的作用，如DNA甲基化異常、microRNA表達以及組蛋白修飾。另外，在組蛋白去乙?；敢泊嬖诋惓５男揎?。H3K27me3是研究較多的組蛋白化學修飾，可沉默基因轉錄及在干細胞分化和致癌中起一定的作用。Janice B及其團隊的實驗研究提出，在異位內膜組織中存在著組蛋白3(H3)的甲基化水平升高，H3K4

7、(組蛋白3賴氨酸4位)、H4K9和H3K27高甲基化、類固醇生成因子-1(SF1)的啟動子乙?；犬惏Y患者和對照組的分泌期子宮內膜組蛋白3賴氨酸4位的三甲基化(H3K27me3)水平均升高。越來越多的證據表明，表觀遺傳修飾異常在子宮內膜異位癥的發(fā)病機制的研究中扮演重要的角色。這些異常的表現包括DNA甲基化、microRNA表達和組蛋白修飾異常等。
　　目前，解釋內異癥相關的惡性腫瘤起源于內異癥的主要有兩大理論。學者們通過大量的

8、組織病理學研究后發(fā)現，內異癥相關的卵巢癌(endometriosis-associated ovarian cancer，EAOC)可能來源于卵巢部位的不典型內異癥。卵巢內異癥的這種組織學異質性表現為子宮內膜腺體伴隨著異質性的細胞學或非典型的鞋釘細胞。La Grenade和Silverberg在1988年首先提出不典型的內異癥與卵巢癌之間有著直接聯(lián)系。在5例卵巢癌患者（其中包括3例透明細胞癌和2例子宮內膜樣癌）中，其卵巢部位均存在不典型

9、的內異癥，其中4例的不典型內異癥病灶鄰近所罹患的卵巢癌。此外，已被證明不典型的內異癥患者發(fā)展為內異癥相關的卵巢癌的風險顯著高于單純的內異癥患者。雖然很多流行病學分析支持不典型內異癥可能是一種癌前病變，并且也可在80％的內異癥相關的卵巢癌中檢測出不典型的內異癥，但這個結論仍然沒有得到足夠多的證據。一些研究提出，內異癥與內異癥相關的卵巢癌所在的微環(huán)境有著相似的介質和細胞因子。但內異癥相關的惡性腫瘤由異位內膜細胞向惡性轉化是否通過它們的中間狀

10、態(tài)——不典型內異癥發(fā)展而來以及它們類似的微環(huán)境之間的聯(lián)系仍未被清楚闡明。
　　內異癥是具有惡性生物學行為的良性疾病，它有與惡性腫瘤相似的惡性生物學行為，如增殖侵襲和遠處轉移的能力，異位內膜可以粘附、侵入和破壞所在部位及其周圍的組織。但內異癥并不像腫瘤那樣引起代謝的變化最終導致死亡。研究發(fā)現，內異癥患者的上皮性卵巢癌和透明細胞癌風險增加。FOXM1在上皮性卵巢癌中表達豐富并與低生存率和耐藥性有關。如今的治療方式可分為癥狀性的和有生育

11、需要的治療，例如手術和常規(guī)的激素治療。所有的這些治療方式都是局限的，并且存在很多副反應。然而，在這些治療中斷之后存在較高的復發(fā)率。
　　叉頭轉錄因子(Forkhead Box M1，FOXM1)是在細胞增殖、分化和轉化過程中發(fā)揮重要作用的一種轉錄因子。作為在腫瘤形成的早期就被上調的蛋白，FOXM1已經被證明在腫瘤的各個階段均起著重要作用。FOXM1在各種各樣的實體腫瘤和血液系統(tǒng)的腫瘤中都存在過表達，如肝細胞癌、急性髓性白血病、胰腺

12、癌和卵巢癌。Ras/MAPK(Ras，ERK)、AKT和p38信號通路是在腫瘤中經常被激活的通路，而這些通路也可以調節(jié)FOXM1的表達。
　　噻唑類抗生素是轉錄因子FOXM1的小分子抑制劑，包括絲裂霉素A和硫鏈絲菌肽，都在多種腫瘤的體內外實驗中被證明有抗腫瘤活性。這些抑制劑可以抑制FOXM1的轉錄，有較高的特異性，而對其他的轉錄因子不會產生影響。硫鏈絲菌肽不僅是一個噻唑類抗生素，而且是一個蛋白酶體抑制劑，調節(jié)FOXM1的轉錄活性和

13、表達。它能通過不同的信號通路在很多的腫瘤細胞中產生抗腫瘤的活性。Maqbool等在甲狀腺乳頭狀癌小鼠體內移植模型中發(fā)現，硫鏈絲菌肽通過抑制FOXM1、MMP2和MMP9的表達抑制腫瘤的發(fā)展，而在體外實驗中，硫鏈絲菌肽同時可以減少腫瘤細胞的侵襲和轉移。
　　目的：
　　在本研究中，我們研究FOXM1在內異癥中的表達，探討雌激素在ERK/FOXM1/MMP9信號通路中的作用機制。最后，在內異癥大鼠模型中使用硫鏈絲菌肽治療異位病灶

14、，以確定其下調FOXM1和MMP9的表達、促進凋亡和減小異位病灶的能力，評估其療效。
　　方法：
　　1、每天在固定的時間進行大鼠陰道涂片，確定動情周期。連續(xù)兩個動情周期正常的大鼠納入本實驗中。50只雌性Wistar大鼠通過自體皮下移植法建立內異癥模型。
　　2、4周后，所有大鼠進行第二次開腹手術觀察異位病灶生長情況，用游標卡尺測量移植物的長寬高(mm)，用公式V=0.52*長*寬*高，計算其體積。
　　3、將造

15、模成功的大鼠隨機分為去卵巢組和治療組，每組分別為20只與30只。去卵巢組大鼠經手術去除卵巢后，進一步隨機分為雌激素組和對照組。術后觀察3天，不給于任何治療。雌激素組的大鼠皮下注射雌激素(10ug/0.1 ml/只/天），而對照組給予等劑量的芝麻油，每組皮下注射7天。治療組隨機分為150mg/kg硫鏈絲菌肽組、250mg/kg硫鏈絲菌肽組和對照組（等量生理鹽水），腹腔注射，兩天一次，共14天。
　　4、用藥結束后，用游標卡尺測量病灶

16、體積。組織學染色證實造模成功，免疫染色檢測FOXM1在異位病灶中的定位和表達情況。Real-time PCR檢測mRNA的水平。Western blot檢測各組ERK/FOXM1/MMP9信號通路相關蛋白和Bcl-2的表達。
　　結果：
　　1、組織病理學染色:第一次開腹手術28天后，組織病理學確認造模成功。肉眼觀，所有造模組的內膜組織均在腹壁發(fā)展為典型的異位內膜病灶，半透明囊球狀結構內含淡黃或清亮無色液體，病灶表面及周圍有

17、血管形成。組織學染色證實可見異位內膜有與正常內膜類似的子宮內膜柱狀上皮細胞的腔樣結構和與腺體。
　　2、FOXM1的免疫學染色:免疫熒光染色顯示FOXM1主要定位在子宮內膜的柱狀上皮細胞和基質細胞的細胞核和細胞質。雌激素組與其相對應的對照組相比，FOXM1表達顯著升高，且主要表達在細胞核。
　　3、FOXM1和MMP9的mRNA表達:熒光定量PCR結果顯示，雌激素組與對照組相比，FOXM1和MMP9基因表達升高(P＜0.05

18、)。
　　結論：
　　1、FOXM1在雌激素組的異位內膜中表達豐富，特別是異位子宮內膜柱狀上皮細胞的細胞核。
　　2、運用雌激素作用后，ERK/FOXM1/MMP9信號通路蛋白表達升高，表明該通路可能參與了內異癥的發(fā)生和發(fā)展。
　　3、硫鏈絲菌肽可以減少內異癥大鼠異位組織FOXM1和MMP9的表達，且呈劑量依賴性，由此推斷硫鏈絲菌肽有望成為治療內異癥的藥物之一。
　　4、硫鏈絲菌肽下調抑制凋亡蛋白Bcl-2