豬鏈球菌2型LuxS-AI-2型密度感應(yīng)系統(tǒng)研究.pdf

1、豬鏈球菌(Streptococcus suis，SS)是引起豬包括腦膜炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎等疾病的重要病原.根據(jù)其莢膜抗原的不同，豬鏈球菌分為35個血清型(1-34型，1/2型)，其中豬鏈球菌2型(Streptococcus suis serotype2，SS2)是一種重要的人畜共患病病原，可以通過直接接觸傳染人，是引起人和豬發(fā)病最常見的血清型. 細菌通常都被認為是自由生活的單細胞生物，絕大部分細菌被認為是被動、獨

2、立地響應(yīng)外界環(huán)境的變化，比如趨化性、趨磁性、趨光性等等；而細菌之間、細菌與其他動植物之間、細菌與環(huán)境之間被認為沒有直接的聯(lián)系.然而，最近的研究表明，密度感應(yīng)(quorum sensing，QS)作為細菌中一種普遍存在的調(diào)控系統(tǒng)，在細菌間的信息交流中起著重要的作用，密度感應(yīng)是細菌通過分泌信號分子(Autoinducer，AI)來監(jiān)測細菌群體密度并協(xié)調(diào)細菌生物功能的信息交流機制，研究細菌與細菌之間的信息交流已成為微生物學(xué)研究的新熱點.

3、 存在于革蘭氏陰性和陽性菌中的luxS/AI-2型密度感應(yīng)系統(tǒng)，可產(chǎn)生用于細菌種間交流的通用信號分子AI-2.細菌許多生理功能都受此系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，包括質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移、生物被膜(biofilm)的形成、毒力因子的調(diào)控和細菌發(fā)光等. 細菌耐藥性的出現(xiàn)迫切需要采用新的方式來進行SS2的防控，干擾或者阻斷SS2的細菌密度感應(yīng)系統(tǒng)，尤其是抑制1uxS/AI-2型密度感應(yīng)系統(tǒng)，可以成為防控SS2的新途徑.本研究首次報道在SS2中存在1uxS/A

4、I-2型密度感應(yīng)系統(tǒng)，通過以下6個方面對該系統(tǒng)進行了相關(guān)研究： 1.豬鏈球菌2型AI-2信號分子檢測 細菌的luxS基因參與信號分子AI-2合成，luxS/AI-2型密度感應(yīng)系統(tǒng)參與調(diào)控細菌眾多的生理功能.豬鏈球菌2型，是一種重要的人畜共患病病原，為探討是否SS2也存在1uxS/AI-2型密度感應(yīng)系統(tǒng)，通過哈維弧菌(Vbrio harveyi)BB170對SS2的檢測結(jié)果表明，SS2可以產(chǎn)生AI-2信號分子；對SS2基因

5、組分析表明，SS2中存在的luxS基因，序列比對結(jié)果表明SS2的luxS基因與哈維弧菌的luxS基因有36％同源性和56％的相似性，與其他鏈球菌的luxS基因同源性都在80％以上，表明在不同的細菌中l(wèi)uxS基因具有高度的保守性；大腸桿菌DH5a互補實驗證實在SS2中l(wèi)uxS參與SS2的AI-2信號分子合成.進一步的研究發(fā)現(xiàn)，AI-2的產(chǎn)生是生長依賴性的，在對數(shù)后期SS2產(chǎn)生的AI-2濃度最大.通過對1uxS/AI-2介導(dǎo)的密度感應(yīng)系統(tǒng)的

6、研究，為進一步研究該系統(tǒng)在SS2中的作用奠定了基礎(chǔ). 2.重組蛋白LuxS與Pfs的表達與純化 在細菌體內(nèi)信號分子AI-2的合成涉及Pfs和LuxS兩個酶的催化作用。通過對SS2的luxS和pfs基因的測序、克隆和表達，獲得了重組的LuxS和Pfs蛋白，用重組蛋白免疫新西蘭白兔制備的免疫血清經(jīng)Western blotting檢測具有良好的免疫原性.對44株SS2分離株的luxS和pfs基因的檢測結(jié)果表明，luxS和pfs

7、在SS2中普遍存在，是SS2中的保守基因.通過對SS2重組蛋白LuxS與Pfs的表達和純化，為AI-2信號分子的體外合成奠定了基礎(chǔ). 3.信號分子的體外合成及其影響因素 AI-2參與調(diào)控細菌一系列重要的生物學(xué)功能，但由于缺少商業(yè)化的AI-2供應(yīng)，限制了對AI-2在SS2中調(diào)控作用的研究.本實驗利用表達純化的SS2的LuxS和Pfs在體外催化SAH，其產(chǎn)物可以誘導(dǎo)報告菌株哈維弧菌BB170發(fā)光，表明SS2的LuxS和Pf

8、s可以在體外催化SAH生成有活性的AI-2分子。進一步的研究表明，在SS2中AI-2的產(chǎn)生來源于S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)代謝：SAM在甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下生成S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosyLhomocysteine，SAH)，SAH對細菌有毒害作用，細菌通過Pfs迅速降解SAH，產(chǎn)生S-核糖同型半胱氨酸(SRH)，LuxS催化SRH形成有活性的AI-2分子.對影響AI-2體外合成因素的

9、研究表明，AI-2的體外合成的最適溫度是37℃，最適pH值是8.0；Cr3+，AI3+和Ba2+促進AI-2的體外合成；Fe2+和Ni2+抑制AI-2的體外合成；Hg2+，Cu2+和Mn2+強烈抑制AI-2的體外合成；而金屬離子Li+，Mg2+和2n2+對AI-2的體外合成基本沒有影響.通過對AI-2體外合成及其影響因素的研究，為進一步研究AI-2對SS2的調(diào)控功能奠定了基礎(chǔ)。 4.AI-2的產(chǎn)生水平與pfs及l(fā)uxS轉(zhuǎn)錄水平分

10、析 AI-2在菌體內(nèi)的產(chǎn)生受多種因素的影響，例如營養(yǎng)條件、溫度、離子強度、pH以及氧氣濃度。為了研究影響SS2產(chǎn)生AI-2的因素，本實驗利用熒光定量PCR技術(shù)研究了SS2不同時期AI-2的產(chǎn)生與luxS和pfs轉(zhuǎn)錄水平之間的關(guān)系，同時分析了葡萄糖、蔗糖以及NaCl對AI-2產(chǎn)生的影響.結(jié)果表明，在SS2中，AI-2的最大活性發(fā)生在對數(shù)生長后期，這和pfs的最大轉(zhuǎn)錄水平相一致，而luxS的最大轉(zhuǎn)錄水平卻發(fā)生在穩(wěn)定期。此外，NaC

11、l和葡萄糖能促進AI-2分子的合成，而蔗糖對AI-2的生成沒有顯著影響.Real-time PCR分析表明，NaCl、蔗糖和葡萄糖都能顯著增加luxS的轉(zhuǎn)錄水平，然而只有NaCl和葡萄糖能增加pfs的轉(zhuǎn)錄水平，蔗糖對pfs的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有顯著的影響.這些結(jié)果表明，AI-2的產(chǎn)生水平與pfs轉(zhuǎn)錄水平一致，而與luxS轉(zhuǎn)錄水平并不一致. 5.噬菌體肽庫篩選LuxS可能的抑制性多肽 噬菌體展示技術(shù)是用來快速篩選抗體、酶、受體和細

12、胞因子等靶蛋白配體的有效工具.本研究運用噬菌體展示技術(shù)，通過3輪的生物淘選和ELISA檢測，篩選到20個陽性克隆，測序結(jié)果表明，在20個陽性克隆中有14個都含有相同的基序HSIR，表明LuxS含有與HSIR結(jié)合的結(jié)合位點，且該位點與HSIR的親和力高.多肽抑制實驗表明，多肽TNRHNPHHLHHV能部分抑制LuxS催化SRH生成AI-2，加入多肽TNRHNPHHLHHV后，LuxS催化SRH形成AI-2的濃度從200μmol降低到150

13、μmol，抑制效率為25％.其余合成多肽對LuxS的活性基本沒有影響.LuxS可能的抑制性多肽與高親和力配體的發(fā)現(xiàn)，為開發(fā)潛在的抑制劑，抑制SS2的luxS/AI-2型密度感應(yīng)系統(tǒng)以及SS2的防控提供了新的可能途徑. 6.AI-2對SS2粘附性的影響以及相關(guān)基因的調(diào)控 AI-2作為細菌間的通用信號分子，參與細菌眾多生理功能的調(diào)控，為了研究信號分子AI-2在SS2對HEp-2細胞粘附中的作用，在SS2對該細胞的粘附實驗中加

14、入不同濃度的AI-2.結(jié)果表明AI-2在濃度為4 umol時，SS2對該細胞的粘附性達到最大為144％，隨著AI-2濃度的增加，SS2對該細胞的粘附性逐漸降低，當AI-2濃度為16umol時，SS2對該細胞的粘附性降低到58％.此外，熒光定量PCR結(jié)果表明AI-2促進pfs的轉(zhuǎn)錄，抑制luxS的轉(zhuǎn)錄；促進毒力因子cps、mrp、sly、gdh和fbps轉(zhuǎn)錄，抑制ef轉(zhuǎn)錄；促進編碼具有免疫原性蛋白的基因MEP，hsp和AbpB的轉(zhuǎn)錄，抑制