內(nèi)生菌誘導子對茅蒼術(shù)細胞揮發(fā)油積累的影響及機理研究.pdf

1、茅蒼術(shù)Atractylodes lancea（Thunb.）DC.為菊科蒼術(shù)屬多年生草本植物。其干燥的根莖為中藥蒼術(shù)，是江蘇省著名的道地藥材。蒼術(shù)主要活性部位是揮發(fā)油，主要功效為燥濕健脾、祛風散寒和明目。近年來由于野生茅蒼術(shù)資源被嚴重破壞，并且茅蒼術(shù)的人工栽培有一定的難度，因此如何解決日益增長的市場需求成為了一個難題。為了保護和開發(fā)茅蒼術(shù)資源，本研究嘗試從微生物和植物生物技術(shù)等角度，研究內(nèi)生真菌誘導子對茅蒼術(shù)懸浮細胞揮發(fā)油積累的影響及機

2、理。
　　 首先本研究建立了茅蒼術(shù)懸浮細胞系，對2種內(nèi)生真菌誘導子對茅蒼術(shù)懸浮細胞產(chǎn)揮發(fā)油的影響進行了初步探討。結(jié)果發(fā)現(xiàn)獲得的茅蒼術(shù)懸浮細胞生長較快，于第21 d 生物量達到最大，為6. 95 g/L。未經(jīng)誘導處理的茅蒼術(shù)懸浮細胞中僅檢出β-桉葉醇，其在培養(yǎng)21 d的細胞中含量達到最大，為17.469μg/g。添加2種內(nèi)生真菌（分別屬于小克銀漢霉屬和孔球孢霉屬，編號為AL4和AL12）的粗誘導子對茅蒼術(shù)懸浮細胞生物量及揮發(fā)油積累

3、均有影響，其中AL4 粗誘導子綜合效果更好。添加AL4 粗誘導子到14 d的茅蒼術(shù)懸浮細胞培養(yǎng)基中，誘導子質(zhì)量濃度為每升培養(yǎng)基含糖20 mg，誘導處理7 d 后收集細胞，發(fā)現(xiàn)其干質(zhì)量比同期對照提高3.31％，且檢出細胞中蒼術(shù)酮、蒼術(shù)醇、β-桉葉醇和蒼術(shù)素的量分別達到14.715、28.395、38.794、 8.310μg/g。其中β-桉葉醇的量是對照的2.22倍。這些結(jié)果表明添加內(nèi)生真菌誘導子對茅蒼術(shù)懸浮細胞的生長及揮發(fā)油積累均有促進

4、作用。
　　 此后以茅蒼術(shù)懸浮細胞揮發(fā)油產(chǎn)量為指標，優(yōu)化了內(nèi)生真菌AL4 誘導子添加濃度和誘導子誘導時間這二個因素。同時，本研究還探討了內(nèi)生真菌誘導子對茅蒼術(shù)懸浮細胞生理態(tài)勢的影響（以不加誘導子的處理為對照），包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶(HMGR)的活性變化，為進一步從機理水平找到提高茅蒼術(shù)懸浮細

5、胞揮發(fā)油產(chǎn)量的方法提供基礎(chǔ)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌AL4 粗誘導子加入到細胞培養(yǎng)體系后，SOD、POD活性顯著增高，而CAT活性在誘導子加入初期被抑制。PAL和PPO 這2種抗性相關(guān)酶分別在誘導子誘導3d和5 d 時出現(xiàn)峰值，而倍半萜合成關(guān)鍵酶HMGR 則在誘導子誘導7 d 時出現(xiàn)峰值。繼它們之后，茅蒼術(shù)懸浮細胞中揮發(fā)油產(chǎn)量在誘導子誘導9 d 時達到最大。
　　 最后對一氧化氮(NO)和過氧化氫(H2O2)在內(nèi)生真菌AL4 粗誘導子

6、促進茅蒼術(shù)懸浮細胞揮發(fā)油生物合成中的作用進行探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌AL4 粗誘導子可以誘發(fā)茅蒼術(shù)懸浮細胞的NO和H2O2 迸發(fā)，而NO 專一性淬滅劑cPITO和H2O2 淬滅劑CAT 則不僅可以分別抑制內(nèi)生真菌AL4 粗誘導子引起的茅蒼術(shù)細胞的NO和H2O2 迸發(fā)，還都能部分阻斷AL4 粗誘導子對茅蒼術(shù)懸浮細胞中揮發(fā)油合成的促進作用。外源添加NO的供體SNP和H2O2 都可引起茅蒼術(shù)懸浮細胞中揮發(fā)油積累增加，但兩者促進揮發(fā)油積累的效果不