檢測(cè)隱孢子蟲(chóng)卵囊的單抗介導(dǎo)IFA和夾心ELISA方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、隱孢子蟲(chóng)是一種重要的人獸共患機(jī)會(huì)性致病原蟲(chóng),可通過(guò)食源和水源等途徑傳播,主要引發(fā)免疫抑制人群和易感動(dòng)物腹瀉,有重要的公共衛(wèi)生意義。免疫學(xué)檢測(cè)方法有特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn),應(yīng)用廣泛。本綜述介紹了免疫熒光技術(shù)、酶免疫分析法、免疫層析法、免疫印跡法、免疫磁珠分離法、流式細(xì)胞儀技術(shù)等幾種常用的隱孢子蟲(chóng)免疫學(xué)檢測(cè)方法,并初步分析了各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。
　　 用飽和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法檢測(cè)出鄭州郊區(qū)某奶牛場(chǎng)奶牛感染安氏隱孢子蟲(chóng)(C

2、.andersoni)的陽(yáng)性樣品。經(jīng)過(guò)飽和蔗糖溶液漂浮法收集安氏隱孢子蟲(chóng)卵囊,用蔗糖密度梯度離心、濾器濾過(guò)提純,通過(guò)凍融和超聲波處理制備顆粒性抗原,免疫Balb/c小鼠。以PEG2000為融合劑,取陽(yáng)性顆粒性抗原免疫鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合,采用間接ELISA方法篩選陽(yáng)性孔方法,通過(guò)3～5次有限稀釋克隆化,篩選出4株持續(xù)分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為4F8-E4-E3、4F8-D10、4G3-F3和4G3-F7；通過(guò)EL

3、ISA、IFA和EITB測(cè)其反應(yīng)性,結(jié)果顯示,4株雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)在1:100～1:12800之間,誘生腹水效價(jià)分別在1:6400～1:102400之間；4株單抗均特異性識(shí)別C.andersoni卵囊壁抗原；免疫印跡表明,4株單抗分別與38～97.2 KDa之間的主要抗原蛋白條帶起反應(yīng)。
　　 隱孢子蟲(chóng)單克隆抗體的制備和應(yīng)用,極顯著地提高了隱孢子蟲(chóng)免疫學(xué)檢測(cè)方法的特異性、敏感性和穩(wěn)定性。筆者建立了間接免疫熒光和雙抗體夾心E

4、LISA兩種檢測(cè)隱孢子蟲(chóng)卵囊的免疫學(xué)方法。以抗安氏隱孢子蟲(chóng)卵囊壁4Fs單抗為一抗,以FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG為二抗,確定4F8單抗最佳稀釋度1:800,4Fs單抗和熒光抗體最佳作用時(shí)間分別為60min和30min。該法檢測(cè)隱孢子蟲(chóng)具有屬特異性,不與艾美耳球蟲(chóng)卵囊和賈第蟲(chóng)包囊發(fā)生交叉反應(yīng),檢測(cè)隱孢子蟲(chóng)卵囊()值是2×102個(gè)/g。對(duì)30頭份疑似感染隱孢子蟲(chóng)的奶牛糞便樣品進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè),并與抗酸染色鏡檢法比較,結(jié)果顯示,抗酸染色法檢測(cè)

5、出7份陽(yáng)性樣品,間接免疫熒光對(duì)這7份判斷為陽(yáng)性外,還對(duì)抗酸染色陰性的2份判斷為陽(yáng)性。本研究為隱孢子蟲(chóng)病的診斷和環(huán)境中隱孢子蟲(chóng)卵囊的檢測(cè)方法提供了參考。
　　 用純化隱孢子蟲(chóng)卵囊制備免疫原,經(jīng)油相苗共6次免疫制備了兔抗安氏隱孢子蟲(chóng)高免血清,提純1gG抗體備用,IgG蛋白濃度為2.183 mg/mL。用兔抗安氏隱孢子蟲(chóng)(Cryptosporidiumandersoni)1gG作為捕獲抗體,抗安氏隱孢子蟲(chóng)單克隆抗體4F8作為檢測(cè)抗體,

6、HIRP標(biāo)記的羊抗鼠lgG為顯示抗體,成功建立從糞便樣品中檢測(cè)隱孢子蟲(chóng)卵囊抗原的雙抗體夾心ELISA方法。試驗(yàn)結(jié)果表明:IgG抗體最佳稀釋度為1:400,即最適包被量為5.5mg.L-1:4F8單抗最適工作濃度1:1600:適宜封閉液為1％BSA-PBST；底物顯色時(shí)間為15min；對(duì)安氏隱孢子蟲(chóng)卵囊的最低檢出量為2×10個(gè)/mL。對(duì)50頭份奶牛糞便樣品分別進(jìn)行飽和蔗糖溶液漂浮、抗酸染色法鏡檢和雙抗體夾心ELISA法檢測(cè),結(jié)果兩種方法都