斜帶石斑魚(yú)干擾素調(diào)節(jié)因子1(IRF-1)的克隆鑒定及特征分析.pdf

1、IRF家族在魚(yú)類非特異性免疫中發(fā)揮重要作用，一直受到人們廣泛關(guān)注。本研究首次分別對(duì)斜帶石斑魚(yú)IRF家族的一個(gè)基因(IRF-1)進(jìn)行克隆，并選擇其中的一個(gè)重要基因：干擾素影響因子1——Interferon regulator factor1(IRF-1)進(jìn)行了克隆鑒定、誘導(dǎo)表達(dá)和初步功能分析，以從分子機(jī)制上對(duì)斜帶石斑魚(yú)的防病和分子疫苗的研制打下基礎(chǔ)。 干擾素影響因子1是干擾素家族的第一個(gè)成員，在免疫應(yīng)答、抗病毒、細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)以及細(xì)

2、胞凋亡等生物過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。 本文對(duì)斜帶石斑魚(yú)的IRF-1基因進(jìn)行了克隆，測(cè)序及各種特征化研究的研究。以PBS做對(duì)照利用polyI:C刺激斜帶石斑魚(yú)(Epnephelus coioides)，然后采肝臟、頭腎、脾臟、肌肉、腦、心臟提取總RNA。根據(jù)相近物種IRF-1的保守序列設(shè)計(jì)引物，PCR得到了保守片段，通過(guò)RT-PCR和RACE-PCR，獲得了斜帶石斑魚(yú)JRF-1基因的cDNA全長(zhǎng)，同樣的方法獲得了IRF-1基因DN

3、A全長(zhǎng)。 EcIRF-1基因cDNA全長(zhǎng)為1759bp，完整ORF框906bp，編碼302個(gè)氨基酸，5’非編碼區(qū)182bp，3’非編碼區(qū)671bp。EclRF-1基因組由十個(gè)外顯子和九個(gè)內(nèi)含子組成，約4.3kb?；?’非翻譯區(qū)包含一個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子，3’非翻譯區(qū)包含一個(gè)外顯子。EcIRF-1基因cDNA與海鱖(Siniperca chuatsi)同源性最高，為85％。將IRF-1 ORF推測(cè)的氨基酸序列與其他物種進(jìn)行比對(duì)

4、，斜帶石斑魚(yú)與海鱖同源性為90％，金頭鯛(sparusaurat)88％，烏鱧(Channa argus)86％，大菱鲆(Scophthalmus maximus)82％。利用ORF)芋列，構(gòu)建原核重組表達(dá)質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切鑒定及測(cè)序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，重組蛋白成功表達(dá)，表達(dá)的蛋白約55 KDa。誘導(dǎo)溫度在37℃時(shí)，重組蛋白主要以包涵體形式存在，但當(dāng)誘導(dǎo)溫度降到30℃的時(shí)，重組蛋白中可溶性蛋白