Sorangium cellulosum So0157-2纖維素降解酶的性質(zhì)與功能分析.pdf

1、粘細(xì)菌(myxobacteria)是一類能夠進(jìn)行滑行運(yùn)動的革蘭氏陰性桿菌，具有復(fù)雜的多細(xì)胞社會學(xué)行為，可以形成種類豐富、功能多樣的生物活性物質(zhì)。根據(jù)對生物大分子的降解特性，粘細(xì)菌可以分為兩大類群:溶纖維素類群和溶細(xì)菌類群。溶纖維素類群中一個重要的屬為堆囊菌屬，而纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)是其中的模式種。
　　 纖維堆囊菌(S.cellulosum)能夠在以結(jié)晶纖維素濾紙為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長，

2、并伴隨著有效的細(xì)胞接觸性的濾紙降解。纖維堆囊菌的纖維素降解特性是其生長發(fā)育的物質(zhì)基礎(chǔ)，是其產(chǎn)生生物活性物質(zhì)的基礎(chǔ)，是分離純化的依據(jù)，也是其分類的重要依據(jù)。但目前對S.cellulosum降解纖維素這一特性的研究卻鮮有報道。
　　 實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，S.cellulosum降解纖維素過程依賴于菌體與底物的相互接觸，進(jìn)而以完整洗滌細(xì)胞建立反應(yīng)體系可檢測到明顯的內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶活性，表明其相關(guān)降解酶組分與細(xì)胞結(jié)合在一起。但其中

3、的酶組分在菌體上的組織方式，仍沒有得到明確解析。此外，酶組分與細(xì)胞的結(jié)合方式使得S.cellulosum中纖維素酶、木聚糖酶等單酶組分的分離純化非常困難，限制了對單酶組分生化性質(zhì)的研究及纖維堆囊菌纖維素降解機(jī)制的研究。實(shí)驗(yàn)室前期對S.cellulosum的研究及纖維素酶特征的分析，發(fā)現(xiàn)S.cellulosum在降解纖維素過程中所采用的策略與目前已有研究的幾種策略均不相同。S.cellulosum在降解纖維素過程中可能具有自己獨(dú)特的降解策

4、略。
　　 本論文的工作在實(shí)驗(yàn)室對S.cellulosum So0157-2測序的基礎(chǔ)上，對單個纖維素酶組分通過基因克隆、異源表達(dá)獲得重組活性蛋白，一方面對單酶的生化性質(zhì)進(jìn)行分析，以了解其在該菌眾多纖維素酶組分中的獨(dú)特性和功能分工;另一方面可以為制備其對應(yīng)的抗體提供材料，為研究S.cellulosum中纖維素酶的空間分布奠定基礎(chǔ)。
　　 本工作選擇S.cellulosum So0157-2基因組中預(yù)測到的唯一的外切葡聚糖

5、酶基因、兩個糖苷水解酶5家族(GH5)的纖維素酶基因和一個GH9家族的含CBM結(jié)構(gòu)域的內(nèi)切葡聚糖酶基因，分別命名為ScCel6A、ScXEG5、ScCelS和ScCel9E。進(jìn)行了基因克隆和表達(dá)，獲得了純化的活性蛋白，開展了酶學(xué)性質(zhì)研究。
　　 將ScCel6A連入表達(dá)載體pET-15b，成功構(gòu)建表達(dá)載體pET-15b-ScCel6A，在E.coli BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，優(yōu)化表達(dá)條件后成功獲得可溶表達(dá)。對蛋白進(jìn)行Ni親

6、和層析和超濾獲得了活性目的蛋白，蛋白純度達(dá)到電泳純。對r-ScCel6A酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其最適pH為6.0;最適溫度為45℃。具有較強(qiáng)的堿耐受性，在pH10的緩沖液中室溫處理18h后，仍能夠保留60％以上的活性。較為適應(yīng)低溫常溫環(huán)境，不能耐受較高溫度，在55℃反應(yīng)時，酶活性便基本完全喪失。Ca2+，pb2+和 Mn2+以1 mM濃度存在時，對酶活有微弱的促進(jìn)作用。多種金屬離子如Cu2+，F(xiàn)e3+，Zn2+，Ag+和Hg2+對r-S

7、cCel6A都有抑制作用，而金屬離子螯合劑EDTA對酶活沒有明顯影響，可用于降低部分金屬離子對酶活的抑制作用。DTT對酶活具有抑制作用。所檢測多糖底物中，r-ScCel6A對PASC表現(xiàn)出最高的降解活性，不具有pNPC降解活性。r-ScCel6A對PASC的Km值為5.02mg/ml，Vmax為4.07μmolmin-1mg-1。作用于多糖的產(chǎn)物主要為纖維二糖，另外含有少量纖維三糖;對寡糖的降解類似，但纖維三糖的降解產(chǎn)物中檢測到纖維二糖

8、，未能檢測到相應(yīng)的葡萄糖，原因有待進(jìn)一步研究。針對r-ScCel6A，制備了多克隆抗體，并對So0157-2不同組分進(jìn)行了western blot細(xì)胞定位，結(jié)果顯示，So0157-2中的外切葡聚糖酶ScCe16A主要存在于膜上，胞內(nèi)和胞外也有部分存在。
　　 將ScXEG5連入表達(dá)載體pET-22b，成功構(gòu)建表達(dá)載體pET-22b-XEG5。優(yōu)化表達(dá)條件后成功獲得可溶表達(dá)。使用Ni親和層析對蛋白進(jìn)行純化。重組酶的最適底物為木葡聚

9、糖，且唯一降解木葡聚糖，為一專一性降解木葡聚糖的內(nèi)切葡聚糖酶（木葡聚糖酶）。r-XEG5最適pH在5.5-6.5左右，r-XEG5在pH4-12廣泛范圍內(nèi)，經(jīng)過室溫18h的預(yù)處理，仍能夠保持接近80％以上的酶活性，且pH仍有可繼續(xù)上升的可能，具有很強(qiáng)的pH耐受性，能夠耐受一定的極端環(huán)境。r-XEG5最適溫度為55℃，不適宜溫度更高的環(huán)境。Ca2+和Ni2+對酶活有一定的促進(jìn)作用。Cu2+，F(xiàn)e3+，F(xiàn)e2+，Cr3+，Zn2+，Co2+

10、，Mn2+，Ag+和Hg2+等對酶活均具有抑制作用。EDTA和DTT對酶活有一定的促進(jìn)作用。
　　 ScCelS的ORF長度為1，209 bp，基因的G+C百分含量為67.49％，接近報道的粘細(xì)菌DNA的G+C百分含量(67-72％)，基因編碼一個含402個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，預(yù)測的蛋白分子量為42.06 kDa，理論等電點(diǎn)pI為5.48。SignalP分析表明，編碼蛋白的N末端存在一個35個氨基酸殘基的信號肽。ScCelS含有

11、單一的纖維素酶催化域。PCR擴(kuò)增ScCelS ORF中編碼成熟蛋白的序列，在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行異源表達(dá)。重組蛋白以胞內(nèi)可溶形式表達(dá)。經(jīng)過鎳柱親和層析和透析，得到了電泳純的有活性的重組蛋白r-ScCelS。重組酶的最適pH為7.5，最適反應(yīng)溫度為45℃，具有較強(qiáng)的pH耐受性及一定的熱穩(wěn)定性。高濃度(10mM)的Cu2+和Fe3+會使酶完全喪失活性，EDTA作為一種絡(luò)合劑，可削弱這種抑制作用。ScCelS對β-1，4-link

12、ed glucan和1，3∶1，4-β-D glucan均具有較強(qiáng)活性，且對1，3∶1，4-β-D glucan的活性更高。ScCelS降解CMC的主要產(chǎn)物為纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖。
　　 ScCel9E序列全長2382bp，G+C百分含量為69.77％,編碼793aa，理論分子量為85kDa，理論等電點(diǎn)為6.67。SignalP分析預(yù)測該蛋白N端含有長34個氨基酸的信號肽。BlastP結(jié)果顯示，該蛋白含有多個結(jié)構(gòu)域，包括

13、纖維素結(jié)合域CBM、可能的類Ig(immunoglobulin)結(jié)構(gòu)域或類Ⅲ型纖連蛋白(fibronectin typeⅢ)結(jié)構(gòu)域或homodimeric/tetrameric/dodecameric相互作用結(jié)構(gòu)域CelD-N、GH9家族催化域CD(catalytic domain)。為研究CBM結(jié)構(gòu)域及CelD-N結(jié)構(gòu)域的功能，我們進(jìn)行了不同程度截短的目的蛋白異源表達(dá)，并進(jìn)行了詳細(xì)的性質(zhì)分析。r-ScCel9E（含CBM、CelD-N

14、、CD）的最適反應(yīng)溫度為35℃左右，0℃時的相對活性為30％左右，低溫情況下活性較高，具有一定的冷適應(yīng)性。該酶不耐高溫，不具有熱穩(wěn)定性。r-ScCel9E的最適pH在6-7.5左右。在不同pH的磷酸鹽緩沖液中預(yù)處理后，殘余酶活均在60％以上，適宜在磷酸鹽緩沖環(huán)境中儲存。Li+,K+和Mg2+在較高濃度時對酶活有一定的促進(jìn)作用;Ca2+的存在對酶活有一定的促進(jìn)作用;DTT在高濃度時對酶活具有一定的促進(jìn)作用。r-ScCel9E對1，3∶1，

15、4-β-Dglucan（barley glucan和lichenan）表現(xiàn)出最高活性;另外，對β-1，4鍵連接的CMC和PASC的活性也較高。產(chǎn)物分析結(jié)果顯示，r-ScCel9E為一個典型的內(nèi)切葡聚糖酶，產(chǎn)物具有不同鏈長的寡糖，且不含單糖。r-ScCel9E-1（含CelD-N、CD，截掉CBM）的最適反應(yīng)溫度為30℃左右，相對于r-ScCel9E有所降低。在0℃時活性為最高活性的60％以上，具有很強(qiáng)的冷適應(yīng)性，比r-ScCel9E高出