玉米核糖體失活蛋白基因z108在大腸桿菌和煙草中表達(dá)及其對(duì)病毒和病原真菌的抗性鑒定.pdf

1、玉米核糖體失活蛋白(MaizeRibosome-InactivatingProtein)是在玉米胚乳中特異表達(dá)的一種具有RNAN-糖苷酶活性的核糖體失活蛋白。它首先以無(wú)活性的單鏈前體蛋白形式合成，經(jīng)水解酶酶解形成由非共價(jià)鍵連接的雙鏈活性毒蛋白。
　　 為了探索玉米核糖體失活蛋白z108基因的特性、功能和抗病機(jī)制，研究工作從以下幾個(gè)方面開(kāi)展:1）建立普通煙草的瞬間表達(dá)轉(zhuǎn)化體系，將含有z108基因的農(nóng)桿菌菌株pCam1301/91-

2、108轉(zhuǎn)化煙草葉肉原生質(zhì)體，并對(duì)其轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行分子生物學(xué)和細(xì)胞學(xué)驗(yàn)證;2）對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行ToMV病毒的接種試驗(yàn)，檢測(cè)轉(zhuǎn)化體對(duì)病毒的抗性作用;3）分離純化大腸桿菌pET/91M-108中表達(dá)的目的蛋白，并測(cè)定z108純化蛋白的抑菌作用。
　　 主要研究結(jié)果如下L
　　 1.煙草原生質(zhì)體細(xì)胞的z108基因轉(zhuǎn)化率為6.82-17.84％。
　　 其中:1）裂解液成分為:1.0％纖維素酶、0.5％離析酶、0.5M甘露醇、5

3、000.0mg/LCaC12，25℃保溫12-14小時(shí);2）葉肉原生質(zhì)體細(xì)胞與根癌農(nóng)桿菌菌株pCam1301/91-108共培養(yǎng)30min，25mg/L潮霉素篩選獲得轉(zhuǎn)化體;3）轉(zhuǎn)化體細(xì)胞經(jīng)PCR和RT-PCR僉測(cè)證明z10基因已整合到煙草原生質(zhì)體細(xì)胞的核基因組中。
　　 2.z108基因T0代轉(zhuǎn)化體單株中88％為目標(biāo)基因和報(bào)告基因共表達(dá)的轉(zhuǎn)化體。
　　 對(duì)已有的z108基因煙草轉(zhuǎn)化體進(jìn)行目的基因及報(bào)告基因Gus的PCR

4、檢測(cè)、RT-PCR、擴(kuò)增產(chǎn)物酶切鑒定以及基因測(cè)序分析，證明z108基因已在煙草植株中轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。
　　 3.z108基因煙草轉(zhuǎn)化體對(duì)ToMV病毒有抑制作用。
　　 病毒接種試驗(yàn)結(jié)果表明，煙草轉(zhuǎn)化體W9和W802單株均對(duì)ToMV病毒的增殖有明顯的抑制作用，花葉癥狀表現(xiàn)較晚，且發(fā)病癥狀不明顯。
　　 4.z108純化蛋白對(duì)病原真菌具有抑制作用。
　　 濃度為0.02329-0.04658μg/μl的z108純