玉米核糖體失活蛋白基因z108在大腸桿菌中的表達(dá)及在煙草和番茄的轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、為進(jìn)行抗病毒基因工程及玉米核糖體失活蛋白抗病機(jī)制研究，本實(shí)驗(yàn)室從玉米(ZeaMaysL)品種農(nóng)大108胚芽中分離克隆得到了玉米核糖體失活蛋白基因z108，其開(kāi)放閱讀框?yàn)?03個(gè)堿基對(duì)，編碼蛋白301個(gè)氨基酸，與Bass(1995)發(fā)表的核苷酸序列的同源性為98.6％，是一個(gè)b-32-like基因。本研究將包含開(kāi)放閱讀框在內(nèi)的玉米核糖體失活蛋白基因片段插入到大腸桿菌表達(dá)載體pET30a(+)的多克隆位點(diǎn)中，誘導(dǎo)其在大腸桿菌菌株BL21(D

2、E3)中表達(dá)，并由農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草(Nicotiana.tobaccum.L)K326和番茄(LycopersiconesculentumMill)品種97-4、櫻紅(Lycopersiconesculentumvar.cerasiforme)，為今后開(kāi)展抗病機(jī)制方面的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。其研究結(jié)果如下：　　1)將包含開(kāi)放閱讀框在內(nèi)的基因片段插入到大腸桿菌表達(dá)載體pET30a(+)的多克隆位點(diǎn)上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21(

3、DE3)，37℃培養(yǎng)細(xì)菌至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期以后，26℃誘導(dǎo)表達(dá)3h。SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果表明，玉米核糖體失活蛋白基因z108已在大腸桿菌菌株BL21(DE3)中獲得表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物為一重組蛋白，分子量大小為52.1KD。這是國(guó)內(nèi)首次在原核生物體中表達(dá)玉米核糖體失活蛋白基因及其編碼蛋白。　　2)將玉米核糖體失活蛋白基因z108插入到雙元載體pCambia1301的NcoI位點(diǎn)上，以根癌農(nóng)桿菌EHA105為介導(dǎo)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，分別在煙草和番

4、茄中表達(dá)了該基因，在含有潮霉素的篩選培養(yǎng)基上，4個(gè)轉(zhuǎn)化菌株pCam91-3-3、pCam92-11-3、pCam91-5-1和pCam92-6-1轉(zhuǎn)化煙草的抗性不定芽分化率達(dá)到了57.45-62.79％，而不合有該基因的空載載體pCambia1301在煙草上的轉(zhuǎn)化率75.34％；轉(zhuǎn)化菌株pCam91-3-3在番茄品種櫻紅和97-4上的轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到了21.57％,22.67％，不含有該基因的空載載體pCambia1301在櫻紅和97-4

5、上的轉(zhuǎn)化率為23.08％，35.82％?！　?)根據(jù)已發(fā)表的基因序列，設(shè)計(jì)特異引物，隨機(jī)對(duì)于煙草轉(zhuǎn)化體91-3-3的5個(gè)植株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，5個(gè)轉(zhuǎn)化體中均有插入基因序列的表達(dá)，這表明，經(jīng)過(guò)潮霉素篩選的轉(zhuǎn)化體植株均含有目標(biāo)基因的插入?！　?)通過(guò)組織染色的方法對(duì)于表達(dá)基因進(jìn)行Gus基因表達(dá)的檢測(cè)，可以觀察到，Gus基因可以在煙草轉(zhuǎn)化體91-3-3的葉片的葉肉細(xì)胞和根毛細(xì)胞的內(nèi)溶物中表達(dá)，而pCambia1301的煙草轉(zhuǎn)化體，