家蠶表皮酪氨酸酶型和漆酶型酚氧化酶分離純化及其酶學性質研究.pdf

1、昆蟲黑化在昆蟲表皮硬化、色素形成、傷口愈合以及抵御病原微生物侵染等過程中起重要作用。黑化是由酚氧化酶催化一系列酚類物質被氧化還原生成醌類物質，醌再經過非氧化還原反應最終生成黑色素反應過程，酚氧化酶是這一過程的關鍵酶（phenoloxidase，PO）。酚氧化酶包括酪氨酸酶型（EC1．14．18．1）和漆酶型酚氧化酶（EC1．10．3．2）。本研究以家蠶（Bombyx mori）表皮為材料，進行酚氧化酶分離純化和酶學性質研究，可為研究昆蟲

2、表皮生成、免疫以及以該酶為靶標新型害蟲抑制劑提供理論依據(jù)。本試驗主要結果如下： 1．家蠶表皮酚氧化酶分離純化。結果表明：酪氨酸酶型酚氧化酶活力在20-30％硫酸銨飽和度時，鹽析得到的蛋白質沉淀酶活力最高；漆酶型酚氧化酶活力在40-70％硫酸銨飽和度時，鹽析得到的蛋白質沉淀酶活力最高。然后又用SephadexG-200凝膠過濾層析對家蠶表皮酚氧化酶進行純化。經兩步純化后，酪氨酸酶型酚氧化酶活力提高了39．70倍；漆酶型酚氧化酶活力

3、提高了4．94倍。 2．酚氧化酶基本酶學性質研究。結果表明：家蠶表皮酪氨酸酶型酚氧化酶最適pH為7．0，最適溫度為30℃，且熱穩(wěn)定性強；漆酶型酚氧化酶最適pH為5．0，最適溫度為60℃，熱穩(wěn)定性較差。酪氨酸酶型酚氧化酶催化鄰苯二酚Km和Vm分別為2．73mmol·L-1和0．91μmol·L—1·min-1。漆酶型酚氧化酶催化（2，2’—氨基—二（3—乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）ABTS Km和Vm分別為0．327mmol·L-1

4、和0．376μmol·L—1·min-1。低濃度金屬離子Ag+、Cu2+、Mn2+、Zn2+對家蠶表皮酪氨酸酶型和漆酶型酚氧化酶都有一定激活作用，而高濃度對其有一定抑制作用。 3．抗壞血酸抑制動力學研究。抗壞血酸能抑制家蠶表皮酪氨酸酶型和漆酶型酚氧化酶活性，其I50分別為175μM和190μM。以鄰苯二酚為底物，抗壞血酸對家蠶表皮酪氨酸酶型酚氧化酶顯示不可逆抑制；以ABTS為底物，抗壞血酸對家蠶表皮漆酶型酚氧化酶顯示不可逆抑制。