棉花GhWRKY41基因的分離與功能分析.pdf

1、植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)遭受多種逆境脅迫，包括生物脅迫（如細(xì)菌、真菌、病毒和植食性昆蟲(chóng)）和非生物脅迫（如干旱、高鹽和極端溫度等）。在這些逆境中，干旱與高鹽最為常見(jiàn)，嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量及質(zhì)量。與動(dòng)物相比，植物不能通過(guò)運(yùn)動(dòng)躲避危害，所以植物主要通過(guò)復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來(lái)增強(qiáng)自身對(duì)逆境的抵御能力。轉(zhuǎn)錄因子在此過(guò)程中起著重要作用。WRKY蛋白是近年來(lái)在植物中發(fā)現(xiàn)的一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，研究表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抵御生

2、物及非生物脅迫和物質(zhì)代謝等生物學(xué)過(guò)程。
　　目前對(duì)WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物抗病方面的作用機(jī)理研究較為透徹，而關(guān)于其在非生物抗性中作用的深入研究起步較慢，而且大多在模式植物中進(jìn)行，在作物中研究較少。棉花是世界范圍的重要作物，其棉纖維及油料的產(chǎn)出具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值與社會(huì)效益。本研究以陸地棉為材料，利用同源克隆與RACE PCR的方法首次分離得到一個(gè)Ⅲ類WRKY基因，同時(shí)利用熒光定量PCR、組織化學(xué)染色及酶活測(cè)定等分子生物學(xué)方法對(duì)該基因的

3、序列特征、表達(dá)特性及生物學(xué)功能進(jìn)行分析，具體結(jié)果如下:
　　(1)本研究利用同源克隆的方法，從棉花中分離得到一個(gè)WRKY基因，命名為GhWRKY41。序列分析表明，GhWKRY41 cDNA全長(zhǎng)為1274bp，其中開(kāi)放閱讀框1068bp，編碼一個(gè)含355個(gè)氨基酸的多肽，該多肽的預(yù)測(cè)分子量為40kDa，等電點(diǎn)為5.42。 DNA結(jié)構(gòu)分析表明，該基因具有兩個(gè)內(nèi)含子。氨基酸序列分析表明GhWRKY41與不同植物中Ⅲ類WRKY蛋白的氨基酸

4、序列具有一定的相似性。蛋白聚類分析表明，GhWRKY41與其他植物中的Ⅲ類WRKY蛋白進(jìn)化關(guān)系較近。
　　(2)利用hiTail-PCR的方法擴(kuò)增得到該基因長(zhǎng)1204bp的啟動(dòng)子片段。通過(guò)PlantCARE及PLACE在線軟件分析發(fā)現(xiàn)，該序列中存在多個(gè)與植物生長(zhǎng)發(fā)育、生物脅迫和非生物脅迫應(yīng)答及組織特異表達(dá)有關(guān)的順式作用元件。
　　(3)亞細(xì)胞定位結(jié)果表明GhWRKY41特異性地定位于細(xì)胞核中。此外，轉(zhuǎn)錄激活活性分析表明GhW

5、RKY41在酵母中能夠激活下游基因的表達(dá)。證明GhWRKY41具備轉(zhuǎn)錄因子的特點(diǎn)。
　　(4)熒光定量PCR結(jié)果表明GhWRKY41的表達(dá)主要受非生物脅迫（如干旱、高鹽、低溫及高溫）的誘導(dǎo)。另外植物激素ABA及信號(hào)分子H2O2也能明顯誘導(dǎo)基因的表達(dá)。
　　(5) GhWRKY41在本生煙中的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了植株對(duì)干旱和鹽脅迫的抗性。GhWRKY41過(guò)表達(dá)植株在干旱及高鹽脅迫下氣孔關(guān)閉明顯。GUS染色表明，在滲透脅迫下，GhWRK

6、Y41在保衛(wèi)細(xì)胞中特異表達(dá)，說(shuō)明GhWRKY41通過(guò)調(diào)控氣孔關(guān)閉增強(qiáng)植物對(duì)干旱及高鹽脅迫的抗性。GhWRKY41介導(dǎo)的氣孔關(guān)閉對(duì)外源ABA敏感，并且其啟動(dòng)子序列中含有多個(gè)ABA響應(yīng)元件。表明GhWRKY41通過(guò)ABA信號(hào)途徑參與植物對(duì)干旱及高鹽脅迫的響應(yīng)過(guò)程。
　　(6)與野生型相比，GhWRKY41過(guò)表達(dá)植株在干旱、高鹽脅迫下的ROS積累量較少，抗氧化酶活性升高更明顯。說(shuō)明GhWRKY411可能通過(guò)調(diào)節(jié)ROS水平參與植物對(duì)干旱、