棉花促絲裂原活化蛋白激酶激酶基因(GhMKK1)的分離及功能分析.pdf

1、植物在其生長過程中不斷地遭受外界環(huán)境的影響，促絲裂原活化蛋白激酶激酶(Mitogen-activated protein kinase kinase，MAPKK)作為MAPK級聯信號傳遞系統(tǒng)(MAPKs)的一部分，在植物響應逆境脅迫中發(fā)揮了關鍵的作用。大量研究表明，MAPKK不僅在響應生物脅迫方面表現出調節(jié)功能，而且在響應非生物脅迫方面也發(fā)揮了重要的作用。然而，目前關于MAPKK響應外界環(huán)境脅迫的研究大多集中在擬南芥等模式植物上，有關農

2、作物中的MAPKK基因研究很少。棉花，作為重要的農作物之一，具有重要的經濟價值和社會效益。因此，本研究以陸地棉（Gossypium hirsutum L.）（魯棉22）為材料，利用同源克隆的方法分離得到一個新的A組MAPKK基因，命名為GhMKK1，并對其進行了序列比對、表達特性分析和功能鑒定，具體研究結果如下:
　　 (1)基因全長序列測定表明，該基因cDNA全長為1234個核苷酸，包括21bp的5’非編碼區(qū)(Untransl

3、ated region，UTR)，127bp的3'UTR和1086bp的開放閱讀框(Openreading frame，ORF)。ORF編碼一個361個氨基酸的多肽，預測其分子量大約為39.945kDa，pI值為5.08。該基因推導的氨基酸序列比對及聚類分析表明，棉花GhMKK1與歐芹PcMKK2、番茄LeMKK1、擬南芥AtMKK1及AtMKK2同源性較高，這些較高同源性的基因都屬于MAPKK中的A組。以上結果表明，我們分離得到的是棉

4、花A組的MAPKK基因，并命名為GhMKK1。
　　 (2)采用RT-PCR的方法對GhMKK1基因在棉花受到外界脅迫時的表達特性進行了研究。結果表明，GhMKK1轉錄水平受高鹽、機械損傷、過氧化氫(Hydrogen peroxide，H2O2)、聚乙二醇(PEG)、低溫(4。C)等非生物脅迫誘導而提高;棉花幼苗受棉花青枯病菌（Ralstonia solanacearum）誘導后，GhMKK1表達量也有所提高;激素信號分子水楊酸

5、(Salicylic acid，SA)和脫落酸(Abscissic acid, ABA)也能不同程度地誘導GhMKK1基因的表達，以上結果表明GhMKK1可能在自身防御過程中發(fā)揮了重要作用。
　　 (3)將GhMKK1構建35S-GhMKK1∶:GFP融合蛋白，采用基因槍方法將融合蛋白轉入到洋蔥表皮細胞中，利用熒光顯微鏡觀察發(fā)現，該基因定位于細胞核及細胞質中，這為GhMKK1發(fā)揮功能提供了組織依據。
　　 (4)將GhM

6、KK1構建正義植物表達載體pB I121-GhMKK1，采用農桿菌介導的方法轉化本生煙（Nicotiana benthamiana）。對部分轉基因植株進行RT-PCR分析，結果證明GhMKK1在轉基因本生煙中成功表達，進一步通過自交得到T1代過表達植株。在分子鑒定基礎上，通過RT-PCR檢測了T1代轉基因植株中GhMKK1的表達水平。以非轉基因的本生煙為對照，超表達GhMKK1的T3代轉基因植株增加了對高鹽、干旱等非生物脅迫的抗性，我們

7、推測該基因可能正調控非生物脅迫抗性。
　　 (5)超表達GhMKK1的轉基因植株接種植物病原細菌煙草青枯病菌和病原菌棉立枯（Rhizoctonia solani）后，轉基因植株中的幾種病原相關基因的表達量較野生型植株均有所降低，轉基因植株顯示了對病原菌的敏感性。以上結果表明，GhMKK1可能在多種生物脅迫反應中發(fā)揮一定作用，并且可能負調控生物脅迫抗性。
　　 綜上所述，GhMKK1提高了轉基因植株對非生物脅迫的抗性，表現