氟苯尼考致小鼠L細胞毒副作用的線粒體途徑的研究.pdf

1、隨著我國畜牧養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，畜禽疫病防控的壓力日益增大，多病原混合感染特別是細菌繼發(fā)感染現(xiàn)象較為普遍，大量抗生素被廣泛應用于畜禽疾病的預防及獸醫(yī)臨床治療，并在飼料中被大量添加以提高飼料轉化率或達到促生長的目的。在此背景下，畜禽生產(chǎn)中濫用和亂用抗菌藥物的現(xiàn)象十分普遍，這給人畜健康和細菌病的防控帶來了巨大挑戰(zhàn)。氟苯尼考（FLO）是一種獸醫(yī)臨床專用的新型廣譜抗菌藥物，目前已成為畜牧及水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中使用范圍最廣、使用量最大的抗菌藥物之一?！?/p>

2、內共生學說”指出真核生物的線粒體起源于古細菌，古細菌寄生于原始生物后隨著長時間的互利共生與演化過程而演變成了細胞線粒體，因此線粒體核糖體在結構和功能上與細菌核糖體具有較高的相似性?；诖?，真核細胞線粒體的核糖體便很容易受到特定抗菌藥物的干擾，并給動物機體或細胞帶來嚴重的毒副作用。FLO能夠與細菌核糖體A位點緊密結合而抑制肽酰轉移酶的活性，最終通過影響蛋白質的合成而殺滅細菌，同時也會影響真核細胞線粒體蛋白質的合成。隨著FLO的大量應用，關

3、于其毒副作用尤其是造血免疫毒性和胚胎毒性的報道也越來越多，但都基于FLO對機體生理機能或組織器官功能的影響觀察或檢測，尚未見到在細胞分子水平上研究FLO毒副作用的報道。為明確FLO對線粒體結構與功能的具體影響，及其對細胞存活、細胞增殖及細胞穩(wěn)態(tài)的毒副作用，本研究以成纖維細胞為研究對象，在細胞及分子水平上研究了FLO對線粒體結構與功能的影響，以及線粒體損傷對細胞增殖、細胞存活及線粒體自噬的影響及其機制，從分子水平揭示了FLO致成纖維細胞毒

4、性的具體機制。
　　一、FLO誘導線粒體結構與功能損傷
　　線粒體作為真核細胞內進行有氧呼吸的主要場所，其結構和功能的完整對細胞的生命活動來說至關重要。本研究首先聚焦在FLO對線粒體結構與功能的影響方面，選用不同劑量的FLO（0.4、0.1、0.025 mg/mL）處理細胞48 h后，主要進行以下實驗：
　?、賅estern blot分別檢測FLO對線粒體核糖體編碼的蛋白質Cox I及細胞質核糖體編碼的蛋白質白Cox

5、IV的表達水平的影響；
　?、谕干潆婄R檢查FLO對細胞內線粒體數(shù)量和形態(tài)結構的影響；
　?、哿魇郊毎g分別檢測FLO對線粒體膜電位及細胞內活性氧簇（ROS）生成量的影響；
　?、苌椒ǚ謩e測定FLO對線粒體呼吸鏈復合體I、II及IV的催化活性及細胞內ATP生成量的影響。結果表明：FLO能夠顯著抑制由線粒體核糖體翻譯的線粒體蛋白如Cox I的表達，進而顯著下調線粒體呼吸鏈復合體I及IV的活性（p＜0.01）、顯著降低線

6、粒體膜電位（p＜0.05或 p＜0.01）及胞內ATP的水平（p＜0.05或 p＜0.01）并提高ROS的生成量；從結構上來說，F(xiàn)LO處理后的細胞內出現(xiàn)了腫脹、空泡化、嵴消失的損傷線粒體。以上結果表明線粒體正常的結構和生理功能受到了FLO的嚴重影響。
　　二、FLO誘導的線粒體功能障礙抑制細胞增殖活性
　　正常線粒體在細胞周期調控和細胞增殖發(fā)育等方面具有重要作用，鑒于FLO可以造成明顯的線粒體功能障礙，我們隨后從以下幾方面研

7、究了FLO對細胞存活、細胞周期和增殖調控的影響：
　　①不同劑量FLO分別處理細胞12 h、24 h、36 h、48 h、60 h及72 h，通過細胞計數(shù)研究細胞增殖曲線；
　?、贑CK-8還原法測定不同劑量FLO處理細胞24 h、48 h及72 h對細胞增殖活性的影響；
　?、跡dU摻入實驗檢測不同劑量FLO處理48 h對細胞DNA復制活性的影響；
　?、芰魇郊毎g檢測不同劑量FLO對細胞周期分布的影響；

8、>　?、萘魇郊毎g及caspase-3活性分析實驗檢測FLO對細胞凋亡的影響；
　　⑥乳酸脫氫酶（LDH）釋放實驗檢測FLO對細胞死亡率的影響；
　?、遅estern blot檢測FLO對細胞內增殖相關信號通路活化狀態(tài)的影響。
　　結果表明：
　　①FLO能導致與劑量有關的細胞活力降低，表現(xiàn)在細胞絕對數(shù)量的下降和增殖活力的降低（p＜0.01）；
　　②EdU摻入試驗及細胞周期檢測結果表明FLO能顯著降低發(fā)生

9、DNA復制的細胞比例，并使細胞周期發(fā)生G0/G1期阻滯（p＜0.05或p＜0.01）；
　　③選用D-半乳糖培養(yǎng)基迫使細胞只能通過線粒體呼吸鏈供能以便于使線粒體毒性物質對線粒體的毒副作用表現(xiàn)得更為明顯，給予FLO后發(fā)現(xiàn)多種細胞表現(xiàn)出了更為嚴重的細胞活力抑制作用（p＜0.01），表明FLO對線粒體呼吸鏈的損傷與其所致的細胞活力下降直接相關；
　?、蹻LO對細胞凋亡率和壞死率無明顯影響（p＞0.05），說明FLO所致細胞活力下降

10、僅與細胞增殖減緩有關，與細胞死亡則無明顯關聯(lián)；
　　⑤從機制上來說，F(xiàn)LO活化了AMPK-mTOR-p70S6K通路，即FLO使活化的AMPK（磷酸化）表達上調、磷酸化的mTOR及磷酸化的p70S6K表達下調，同時ROS-p53-p21通路也被活化，AMPK特異性抑制劑Compound C和抗氧化劑NAC分別能夠特異性抑制上述相應通路的活化并提高被FLO抑制的細胞增殖活性（p＜0.05或p＜0.01）。
　　三、FLO導致細

11、胞內損傷線粒體清除障礙及細胞衰老發(fā)生
　　線粒體自噬對損傷線粒體的清除和細胞穩(wěn)態(tài)的維持至關重要，鑒于FLO可以造成明顯的線粒體功能障礙，我們隨后從以下幾方面研究了FLO對細胞內損傷線粒體的清除過程即線粒體自噬的影響：
　?、賅estern blot檢測FLO對胞內線粒體質量（線粒體內膜蛋白Tim23水平）的影響；
　?、谑褂镁€粒體特異性探針MitoTracker Green染色線粒體，并用流式細胞術檢測FLO對細胞內線

12、粒體數(shù)量的影響；
　?、凼褂米允上嚓P蛋白LC3的特異性抗體染色結合共聚焦顯微鏡檢查FLO處理的細胞內自噬點的形成情況；
　　④Western blot檢測FLO對自噬相關蛋白LC3B II/I及p62的表達水平，以評估細胞自噬水平；
　?、菟ダ舷嚓Pβ-半乳糖苷酶染色檢測FLO處理8 d所造成的的損傷線粒體累積對細胞衰老水平的影響；
　?、轜estern blot檢測FLO對招募至損傷線粒體的線粒體自噬起始關鍵蛋白

13、Parkin及p62水平的影響，結合ROS清除劑NAC研究p53蛋白對Parkin向線粒體轉位的影響；
　　⑦MitoTracker Green染色結合流式細胞術檢測NAC對線粒體自噬或損傷線粒體清除功能的調節(jié)作用。
　　結果表明：
　　①細胞自噬功能在FLO處理的細胞中處于抑制狀態(tài)，表現(xiàn)在自噬相關蛋白LC3B II下降和p62蛋白表達水平上升，細胞內LC3熒光聚點的數(shù)量在不同處理組間無顯著差異；
　　②胞內線粒

14、體內膜蛋白Tim23的水平在FLO給藥后輕微升高，F(xiàn)LO處理組的Mitotracker Green熒光值顯著升高，表明FLO處理后損傷的線粒體并不能通過自噬有效清除，而是堆積在細胞內；
　?、跴arkin蛋白從胞漿被招募到線粒體是線粒體自噬的關鍵環(huán)節(jié)，本研究發(fā)現(xiàn)FLO處理后線粒體膜上Parkin蛋白的量及其招募的p62蛋白的量都未升高，表明FLO所致線粒體自噬異常與Parkin蛋白的線粒體轉位障礙有關；
　?、苁褂肗AC和F

15、LO共處理細胞后發(fā)現(xiàn)Parkin蛋白線粒體轉運障礙能夠得到緩解，結合先前p53蛋白抑制Parkin蛋白線粒體轉位的報道可知，F(xiàn)LO處理活化了ROS-p53通路并通過抑制Parkin蛋白的線粒體轉位發(fā)揮線粒體自噬抑制效應，進而使損傷的線粒體得不到有效清除并最終導致細胞衰老的發(fā)生。
　　本研究從分子水平揭示了氟苯尼考致成纖維細胞毒性的具體機制，研究結果對于明確線粒體毒性藥物的毒性機制具有重要借鑒意義，有助于指導氟苯尼考在畜牧及水產(chǎn)養(yǎng)殖