H5,H6,H7亞型AIV重組株對(duì)BALB-c小鼠致病的潛力分析和機(jī)制探討.pdf

1、流感病毒的基因組由八個(gè)單股負(fù)鏈的RNA組成，當(dāng)不同的流感病毒感染同一宿主細(xì)胞時(shí)，病毒間會(huì)發(fā)生基因片段的交換，既基因重組。基因重組是流感病毒演化的一個(gè)重要驅(qū)動(dòng)力，其通過(guò)改變流感病毒感染的宿主范圍、致病性和傳播能力等生物學(xué)特性，使流感病毒具備在人和動(dòng)物群體間流行甚至大暴發(fā)的潛力，這種潛力對(duì)公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了一定威脅。從90年代始，H5、H6和H9亞型禽流感病毒就在多種鳥(niǎo)類中共存并流行，這為病毒間的基因重組提供了便利。近年來(lái)，禽流感病毒變異重

2、組加速，導(dǎo)致不同HA亞型和NA亞型的組合出現(xiàn)并流行。這些HA亞型和NA亞型的組合不僅可以感染家禽和野鳥(niǎo)，甚至可以感染人。因此，及時(shí)了解禽流感病毒的遺傳演化、重組規(guī)律和致病性，對(duì)完善禽流感的防控機(jī)制具有重要的意義。
　　為了解近年來(lái)H5Nx和H7N9亞型禽流感病毒全基因組的遺傳演化情況，本研究對(duì)30株H5Nx亞型和4株H7N9亞型禽流感病毒進(jìn)行基因序列和遺傳演化分析。H5Nx的HA基因序列分析結(jié)果表明：30株H5亞型禽流感病毒主要分

3、布在7.2分支、2.3.4分支、2.3.2.1分支和2.3.4.4分支。其中7.2分支和2.3.4.4分支為優(yōu)勢(shì)分支。大多數(shù)H5N2亞型禽流感病毒位于7.2分支，大部分H5N1、H5N6和H5N8亞型禽流感病毒位于2.3.4.4分支。30株H5Nx毒株HA蛋白的主要抗原區(qū)氨基酸序列與疫苗株Re-1（A/goose/Guangdong/1/1996）、Re-4(A/chicken/Shanxi/1/2006)、 Re-5(A/duck/A

4、nhui/1/2006)、Re-6(A/duck/Guangdong/s1322/2010)、Re-7（A/chicken/Liaoning/s4092/11）和Re-8(A/chicken/Guizhou/4/2013)相比，位于2.3.4.4分支的毒株與Re-8疫苗株的變異范圍為0％?50%；位于2.3.2.1分支的毒株與Re-6疫苗株的變異率為20%；位于2.3.4分支的毒株與Re-5疫苗株的變異率為20%；位于7.2分支的毒株與

5、Re-4疫苗株的變異范圍為26%?36%，與Re-7疫苗株的變異范圍為0%?20%。30株H5Nx亞型禽流感病毒全基因組的遺傳演化分析結(jié)果表明：這些H5Nx亞型禽流感病毒為同一亞型禽流感病毒的不同基因型或不同亞型禽流感病毒重組后產(chǎn)生的病毒；H7N9亞型禽流感病毒的遺傳演化分析結(jié)果表明，H7N9亞型禽流感病毒為不同亞型禽流感病毒重組后產(chǎn)生的病毒。其HA基因來(lái)自H7-like/Eurasia lineage分支，NA基因來(lái)自N9-like/

6、Eurasia lineage分支，內(nèi)部基因均來(lái)自H9N2-like/Eurasia lineage分支。因此，近年來(lái)分離的H5和H7亞型禽流感病毒的確存在不同程度的變異重組。
　　本研究利用反向遺傳學(xué)技術(shù)模擬H5N1、H6N2和H7N9亞型禽流感病毒的自然重組，探索這些重組病毒對(duì)BALB/c小鼠的致病性和其差異的分子基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：可成功拯救出H5N1和H6N2亞型禽流感病毒單基因片段相互替換的重組病毒，預(yù)示這些病毒可自然重

7、組。獲救的重組病毒以106EID50的劑量經(jīng)鼻腔感染BALB/c小鼠后，結(jié)果顯示，DK65（H6N2）的PB2基因和NS基因單獨(dú)替換CA1(H5N1)相應(yīng)基因時(shí)，可使獲救重組病毒對(duì)小鼠的致病性降低；CA1（H5N1）的NS基因單獨(dú)替換DK65（H6N2）相應(yīng)基因時(shí)，可使獲救重組病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制能力增強(qiáng)。因此，NS基因是CA1（H5N1）和DK65（H6N2）對(duì)小鼠致病力差異的決定因素。用DK65（H6N2）的NS基因單獨(dú)替換C381

8、(H5N1)相應(yīng)基因時(shí)，可使獲救重組病毒對(duì)小鼠的致病性降低；C381（H5N1）的NS基因單獨(dú)替換DK65（H5N1）的相應(yīng)基因時(shí)，可使獲救重組病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制能力增強(qiáng)。因此，NS基因是C381（H5N1）和DK65（H6N2）對(duì)小鼠致病力差異的決定因素。H5N1和H7N9亞型禽流感病毒之間進(jìn)行單基因片段相互替換時(shí)，也能成功拯救出16株重組病毒，預(yù)示這些病毒也可自然重組。獲救的重組病毒同樣以106EID50的劑量經(jīng)鼻腔感染BALB/

9、c小鼠后發(fā)現(xiàn)：GD134（H7N9）的PA基因單獨(dú)替換CA1（H5N1）相應(yīng)基因時(shí)，可使獲救重組病毒對(duì)小鼠的致病性降低；CA1（H5N1）的PA基因單獨(dú)替換GD134（H7N9）相應(yīng)基因時(shí)，可使獲救重組病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制能力增強(qiáng)。因此，PA基因是CA1（H5N1）和GD134（H7N9）對(duì)小鼠致病力差異的決定因素。綜上所述，H5N1、H6N2和H7N9亞型禽流感病毒可自然重組出新的重排病毒，且當(dāng)重組病毒攜帶H5N1亞型禽流感病毒的PA