miR-127靶向抑制ACO2基因表達及其通路研究.pdf

1、豬骨骼肌肌纖維類型和結(jié)構(gòu)特征是影響豬肉品質(zhì)的一個關(guān)鍵因素。本研究結(jié)合課題組前期高通量測序的結(jié)果和數(shù)據(jù)分析，以可能調(diào)控肌纖維類型的miR-127為研究對象，旨在闡述miR-127靶向基因及其調(diào)控通路。
　　本試驗以60頭閹割杜×（長×大）豬（DLY）63d、98d和161d背最長肌為試驗樣品，通過制作石蠟切片和HE染色測定不同發(fā)育階段其肌纖維類型比例。后又以1日齡 DLY仔豬為試驗對象，分離出原代豬骨骼肌衛(wèi)星細胞，轉(zhuǎn)染 miR-12

2、7 mimics/inhibitor，運用實時熒光定量PCR（SYBR Green I）方法測定骨骼肌衛(wèi)星細胞中ACO2、SETD8、MEF2、MAPK1、MAPK3、MAPK4和MYH7等肌纖維發(fā)育相關(guān)基因表達量，同步采用Western blot的方法測定骨骼肌衛(wèi)星細胞中MYH7蛋白的表達量。配制無賴氨酸的細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)骨骼肌衛(wèi)星細胞24h后收集細胞，測定MEF2和 MYH7基因表達量。最后通過構(gòu)建載體，將正常序列 ACO2-Tar

3、getN和突變序列ACO2-TargetM分別連接到含有螢光素酶報告基因的質(zhì)粒，試驗組與 miR-127的mimics共轉(zhuǎn)染進293A細胞，對照組與陰性對照NC共轉(zhuǎn)染進293A細胞，結(jié)合螢光素酶活性檢測來驗證miR-127與ACO2之間的靶位關(guān)系。
　　結(jié)果表明：
　　1.隨著豬日齡的增加，Ⅱa型紅肌纖維所占比重逐步減少，63d齡所占比重顯著高于98d和161d齡，98d和161d齡之間所占比重差異不顯著；隨著豬日齡的增加，

4、Ⅱx+Ⅱb型白肌纖維所占比重逐步增多，63d齡所占比重顯著低于98d和161d齡，98d和161d齡之間所占比重差異不顯著。
　　2.骨骼肌衛(wèi)星細胞轉(zhuǎn)染miR-127的模擬物mimics之后，細胞中慢肌纖維MYH7基因和蛋白表達量顯著下降，ACO2、MEF2和MAPK3基因表達量顯著下降，對 SETD8、MAPK4和 MAPK1的基因表達無顯著影響；而轉(zhuǎn)染miR-127的抑制劑inhibitor之后，細胞中慢肌纖維MYH7基因表達

5、量無顯著變化、但蛋白表達量顯著上升，ACO2和MEF2的基因表達顯著上升，對 SETD8、MAPK4、MAPK3和 MAPK1的基因表達無顯著影響。
　　3.無賴氨酸培養(yǎng)基培養(yǎng)骨骼肌衛(wèi)星細胞試驗中，在缺乏賴氨酸的條件下，骨骼肌衛(wèi)星細胞中MEF2基因表達顯著下降，MYH7基因表達也表現(xiàn)出下降趨勢，但差異不明顯。
　　4. miR-127的mimics能使pmirGLO-ACO2-TargetN質(zhì)粒螢火蟲熒光素酶活性降低38.3