大豆MYBZ2轉(zhuǎn)錄因子與外源次級信號分子(NO與MeJA)對長春花毛狀根長春質(zhì)堿生物合成的分子調(diào)控機理研究.pdf

1、長春花屬于夾竹桃科長春花屬，含有130多種生物堿，其中絕大多數(shù)具有藥理學功效。特別是雙萜吲哚生物堿，如3’，4’-anhydrovinblastine， vincristine和vinblastine等具有抗癌功效，這些抗癌成分都是由前體物質(zhì)vindoline和catharanthine合成。盡管這些物質(zhì)藥效顯著，但在植株中含量極低，只有十萬分之幾甚至百萬分之幾，因此市場上供不應(yīng)求，價格昂貴。由于長春花吲哚生物堿合成機理的復雜性，使得幾

2、十年來一直未能成功實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。因此，解析長春花吲哚生物堿合成的分子調(diào)控機理成為工業(yè)化生產(chǎn)的迫切需要。
　　 本實驗通過利用野生型發(fā)根農(nóng)桿菌A4浸染長春花無菌葉片獲得了9個毛狀根系，PCR檢測發(fā)現(xiàn)，這九個根系都整合了Ri質(zhì)粒左邊界的RolAB基因，其中有五個根系整合了Ri質(zhì)粒右邊界的Ags基因。HPLC檢測同時含有RolAB基因和Ags基因的根系中catharanthine含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)達到了0.38-0.56mg/gFW,而

3、對照的天然植株根部中未檢測到catharanthine含量。Real-timePCR相對定量分析TIAs途徑相關(guān)基因表明，負調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子基因Zct1、Zct2表達水平下降，正調(diào)控因子Orca2、Orca3表達水平上升，其它各個關(guān)鍵酶基因(ASα、Tdc、Dxs、Dxr、Hds、Mecs、G10h、Sls、Str、Sgd、Cpr)均上調(diào)表達。這表明了Ri質(zhì)粒T-DNA區(qū)相關(guān)基因?qū)IAs合成途徑相關(guān)基因進行了全局調(diào)控，從而提高了catha

4、ranthine含量。
　　 通過利用野生型發(fā)根農(nóng)桿菌A4把從大豆品種“中豆27”中分離克隆的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子GmMYBZ2(DQ902861)導入到長春花毛狀根中，獲得了36個Kan抗性根系，其中有26個根系GUS染色呈陽性，24個根系整合了RolAB基因，17個根系整合了Ags基因，28個根系整合了GmMYBZ2基因。在這36個Kan抗性根系中，23個根系同時整合了GmMYBZ2基因、RolAB基因，16個根系同時整

5、合了GmMYBZ2基因、RolAB基因和Ags基因，從23個根系中選取6個根系用PCR-SouthernBlotting檢測GmMYBZ2基因，結(jié)果均為陽性。HPLC檢測這6個PCR-SouthernBlotting檢測陽性根系中catharanthine含量，結(jié)果顯示這些根系含量均在0.2-0.25mg/gFW之間。Real-timePCR相對定量分析TIAs途徑相關(guān)基因表明，Cpr、PGGT-I、Tdc、Zct1、Pal基因上調(diào)表達

6、，其中上調(diào)幅度最大的是Zct1，而ASα、Orcα3、Str三個基因的表達水平卻明顯下調(diào)。結(jié)果說明GmMYBZ2基因通過對ASα、Orca3、Str、Zct1、Pal基因的調(diào)控來降低catharanthine含量。這些基因的下調(diào)表達可能與GmMYBZ2轉(zhuǎn)錄因子C端所特有的一個隱藏的鋅指結(jié)構(gòu)和一段保守的氨基酸基序PDINLELTIS有密切的關(guān)系。
　　 生長指數(shù)測定發(fā)現(xiàn)，A4-MYBZ2根系的生長速度比A4根系慢，通過對長春花細胞

7、周期蛋白CYSA和CYMB相對定量分析，發(fā)現(xiàn)A4-MYBZ2根系的CYSA和CYMB表達水平與A4根系相比下調(diào)50％左右，但都高于天然植株根部的表達水平。這表明GmMYBZ2基因、Ri質(zhì)粒T-DNA區(qū)相關(guān)基因參與了長春花細胞分裂調(diào)控。
　　 用SNP(10mmol/L)、MeJA(50mg/L)、SNP+MeJA處理A4根系，同時過表達ORCA3基因的根系，以及對照的A4根系等五個不同根系分別在第2d、第4d、第6d、第8d取材

8、來分析catharanthine含量和TIAs合成途徑相關(guān)基因的相對變化譜。結(jié)果表明，外源NO在調(diào)控TIAs合成途徑中，發(fā)揮著一個負調(diào)節(jié)因子的作用。NO除對CPR，ZCTs表達起到促進作用之外，其余被檢測的基因均為下調(diào)表達，與MeJA的作用截然相反，說明NO與MeJA在調(diào)控TIAs途徑中表現(xiàn)出拮抗。同時也說明ZCTs是NO信號途徑的一個重要靶點。HPLC檢測catharanthine含量發(fā)現(xiàn)，MeJA提高catharanthine含量，