蘋果鈣反向轉(zhuǎn)運體基因的克隆、表達特性及其功能分析研究.pdf

1、Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運體是一類跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，是Ca2+重要外向轉(zhuǎn)運器，在植物的營養(yǎng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著非常重要的作用。蘋果是我國的重要果樹，鈣對蘋果生長、果實品質(zhì)、貯運性等方面具有重要的影響。蘋果果實缺鈣可導(dǎo)致苦痘病、水心病等成熟期和貯藏期間生理性病害，給我國的蘋果生產(chǎn)造成巨大損失。
　　 本文從‘長富6號’蘋果中克隆了Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運體基因-MdCAX1，比較了該基因與其它物種該基因的同源性，分析了該基因的結(jié)構(gòu)；克隆了該基因

2、的啟動子序列，分析了啟動子序列的調(diào)控元件的結(jié)合位點；研究了該基因的時空表達以及鈣處理條件下的表達特性；借助于綠色熒光蛋白，對該基因基因的亞細胞定位進行了研究；構(gòu)建酵母表達載體，運用酵母鈣離子轉(zhuǎn)運缺陷體(K667)，對該基因的功能進行了研究；構(gòu)建植物雙元表達載體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)該載體轉(zhuǎn)化煙草，對該基因的功能進行了研究；構(gòu)建果實特異啟動子2A11控制的該基因的植物雙元表達載體，轉(zhuǎn)化番茄，為今后運用基因工程提高蘋果品質(zhì)，提供了理論依據(jù)。主要研究結(jié)

3、果如下：
　　 1、以擬南芥CAX1基因的序列為源序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中的蘋果EST中進行同源搜索，獲得100條同源序列，用DNASTAR軟件中的SeqMan進行電子拼接，獲得一段大小為1350bp的ORF編碼區(qū)，將其命名為：MdCAX1。根據(jù)該序列設(shè)計一對特異引物，在‘長富6號’蘋果cDNA中進行擴增，結(jié)果獲得一條1350bp大小的特異條帶。根據(jù)獲得的ORF編碼區(qū)，分別在其上下游設(shè)計兩對巢式PCR引物，進行RACE，分別獲得了

4、一段大小為1168bp的和253bp的片段。去除編碼區(qū)序列，獲得126bp的5’UTR和402bp的3’UTR。將獲得的cDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列在NCBI官方網(wǎng)站進行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)其與網(wǎng)上公布的CAX基因及蛋白有較高的同源性，其中與豇豆的同源性最高，核苷酸同源性為75％，氨基酸為73％。此外結(jié)構(gòu)分析表明，蘋果MdCAX1蛋白同樣具有CAX蛋白家族所共有的兩個特殊結(jié)構(gòu)：氮末端調(diào)節(jié)區(qū)(NRR)和鈣結(jié)合區(qū)（CaD）。同源進化樹分

5、析表明：CAX蛋白家族可分為兩大類，其中MdCAX1與同源性較高的VCAX1、CAX1和CAX3在亞分支聚為一類。
　　 2、采用克隆MdCAX1全長編碼區(qū)相同的引物，以‘長富6號’蘋果的總DNA為模板，通過PCR擴增、測序，獲得一條長度為3543bp的DNA序列，使用在線內(nèi)合子分析軟件Genscan，結(jié)合獲得的該基因的ORF編碼區(qū)，對該序列進行內(nèi)含子分析，該基因DNA序列有10個內(nèi)含子和11個外顯子。Southern blot

6、ting分析表明，在蘋果基因組里，MdCAX1基因可能有2-3個拷貝。根據(jù)克隆的MdCAX1基因DNA序列，在靠近5’端的外顯子區(qū)反向設(shè)計兩條巢式引物，以加了接頭的‘長富6號’蘋果的總DNA的酶切產(chǎn)物為模板，通過PCR擴增、測序，獲得3條片段，長度分別為2362bp、888bp、573bp，經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)該三條片段為同一序列，只是長短不同。順式調(diào)控元件分析表明：該啟動子除了具有TATA-BOX5、光誘導(dǎo)元件、生長素調(diào)控元件、銅離子和氧誘導(dǎo)調(diào)

7、控元件、赤霉素調(diào)控元件、光誘導(dǎo)元件、脫水和黑暗誘導(dǎo)元件、生物鐘調(diào)控元件、水楊酸誘導(dǎo)元件、病原菌和鹽誘導(dǎo)調(diào)控元件、磷缺乏調(diào)控元件和乙烯調(diào)控元件之外，還發(fā)現(xiàn)了兩種與鈣離子密切相關(guān)的調(diào)控元件：一種是鈣離子響應(yīng)元件，另一種是鈣調(diào)素調(diào)控元件。
　　 3、以‘長富6’號蘋果為材料，應(yīng)用熒光定量PCR的方法，研究了MdCAX1的時空表達規(guī)律及其對多種金屬離子的脅迫反應(yīng)，結(jié)果表明：MdCAX1基因在蘋果果實中花后8周存在一個表達高峰，經(jīng)過噴鈣處

8、理的同時期果實沒有該表達高峰；在離體浸鈣處理的果實中，經(jīng)過六小時處理后表達量也出現(xiàn)了一個高峰；在葉片中，前期的表達量較高，6月4日后表達量開始下降；在莖、葉、花中都有較強的表達，尤其在是花中，表達量最高，而在果實的表達量很低；在鈣離子和錳離子的誘導(dǎo)后，表達量較水處理對照有大幅度的提高。
　　 4、構(gòu)建了MdCAX1基因亞細胞定位載體以及該基因和其短截基因的酵母表達載體，研究了該基因的亞細胞定位和該基因在K667的功能。結(jié)果表明：

9、該基因是一個定位在質(zhì)膜上的跨膜蛋白，不管是原初的MdCAX1基因還是該基因的短截片段都可以互補K667的轉(zhuǎn)運鈣離子的功能。
　　 5、構(gòu)建了一種特殊的MdCAX1基因植物雙元表達載體，可以通過常規(guī)PCR擴增，判斷外源基因插入的拷貝數(shù)。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)入到煙草K326中，獲得了48棵潮霉素抗性苗，經(jīng)過GUS染色檢測后，獲得4棵GUS陽性苗，分別命名為A、B、C、D。PCR、RT-PCR和Southern blotting檢測

10、表明：該4個株系均為陽性。PCR擴增檢測拷貝數(shù)表明：株系A(chǔ)、C、D均為單拷貝，而株系B為多拷貝，Southern blotting檢測拷貝數(shù)結(jié)果與PCR擴增檢測一致。轉(zhuǎn)基因煙草的4個株系中，株系C和株系D的鈣離子含量顯著高于對照，分別比對照提高了22.9％和13.58％,株系A(chǔ)的鈣離子含量雖沒有顯著高于對照，但其含量也對照提高了12.8％，而株系B的鈣離子含量與對照相比，顯著低于對照中的鈣離子量，比對照降低了13.1％。對于錳離子含量而

11、言，4個轉(zhuǎn)基因株系中，株系D顯著高于對照，比對照提高了147.5％，而其它3個株系A(chǔ)、B、C都顯著低于對照，分別為對照的75.3％、71.1％、83.7％。鎂離子含量比較發(fā)現(xiàn)，株系A(chǔ)、B、C顯著低于對照，分別為對照的86.3％、77.6％、73.4％，而株系D的含量與對照相當，為對照的100.5％，沒有顯著差異。
　　 6、構(gòu)建了該基因的番茄果實特異啟動子2A11控制的植物雙元表達載體p2A11::MdCAX1，將其轉(zhuǎn)入到番茄中

12、，獲得了28個潮霉素抗性苗，GUS染色檢測后，獲得了4個GUS陽性株系，GUS陽性率為14.3％,PCR和RT-PCR進一步檢測發(fā)現(xiàn)，該4個GUS陽性株系皆為陽性。轉(zhuǎn)基因番茄表型觀察表明，株系B株型矮小緊湊、腋芽分枝多，花蕾和復(fù)葉面積均比對照小，并且其開花期顯著晚于對照，比對照遲49天，而株系C株型略低于對照，但其花蕾和復(fù)葉均比對照大。金屬元素含量的測定表明，獲得的部分轉(zhuǎn)MdCAX1基因的番茄株系顯著提高了Ca2+、Mg2+、Mn2+的