黏蟲(chóng)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)與功能分析.pdf

1、黏蟲(chóng)Mythimna separata(Walker)是一種多食性昆蟲(chóng)，由于其具有遠(yuǎn)距離的遷飛習(xí)性，導(dǎo)致其在我國(guó)危害范圍廣，給我國(guó)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。隨著轉(zhuǎn)基因作物在全世界范圍大規(guī)模的推廣種植，在減少化學(xué)殺蟲(chóng)劑的使用的同時(shí)也高效的控制住了相關(guān)害蟲(chóng)的為害?，F(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因作物絕大部分是轉(zhuǎn)Bt（Bacillusthuringiensis）基因，因?yàn)槠洚a(chǎn)生的殺蟲(chóng)晶體蛋白對(duì)昆蟲(chóng)有著特異性殺蟲(chóng)作用，但隨著其對(duì)害蟲(chóng)的選擇壓力的增加，相關(guān)害

2、蟲(chóng)對(duì)Bt抗性問(wèn)題已經(jīng)日益嚴(yán)峻，本研究則是以黏蟲(chóng)為研究對(duì)象，在已經(jīng)獲得黏蟲(chóng)ABC(ATP-binding cassette)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MsABCC2(GenBank登錄號(hào)為KJ930171.1)和MsABCC3基因cDNA全長(zhǎng)的基礎(chǔ)上，測(cè)定了該基因在幼蟲(chóng)體內(nèi)不同齡期及不同組織中的相對(duì)表達(dá)量，同時(shí)使用RNAi(RNA interference)技術(shù)研究了ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能。主要結(jié)果如下:
　　1.黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)MsABCC2和MsABCC3

3、蛋白基因的相對(duì)表達(dá)量
　　利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，以β-actin為內(nèi)參基因，結(jié)果采用2-△△CT分析方法，得到了幼蟲(chóng)在不同齡期和不同組織中的MsABCC2和MsABCC3的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示:在不同齡期幼蟲(chóng)中MsABCC2蛋白基因表達(dá)量差異顯著(P＜0.05)。6齡幼蟲(chóng)體內(nèi)的基因相對(duì)表達(dá)量最高，但與4齡、5齡幼蟲(chóng)并沒(méi)有顯著性差異;3齡幼蟲(chóng)體內(nèi)的基因相對(duì)表達(dá)量最低，但與2齡幼蟲(chóng)并沒(méi)有顯著差異。對(duì)于MsABCC3而言，6齡幼蟲(chóng)

4、體內(nèi)的基因相對(duì)表達(dá)量最高，與其他齡期均有顯著性差異，5齡幼蟲(chóng)體內(nèi)的基因相對(duì)表達(dá)量最低，與4齡幼蟲(chóng)相比差異顯著，但與2齡和3齡幼蟲(chóng)并沒(méi)有顯著差異。在檢測(cè)4～6齡幼蟲(chóng)中腸和除中腸之外的蟲(chóng)體MsABCC2和MsABCC3蛋白基因表達(dá)量中，發(fā)現(xiàn)4～6齡的幼蟲(chóng)中腸中MsABCC2和MsABCC3蛋白基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著的高于除中腸之外的蟲(chóng)體，可以說(shuō)明MsABCC2和MsABCC3大部分在黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)的中腸處表達(dá)。
　　2.黏蟲(chóng)ABC蛋白基因的

5、RNAi和沉默后的生物學(xué)測(cè)定
　　根據(jù)MsABCC2和MsABCC3基因序列分別設(shè)計(jì)了3個(gè)siRNA，分別為si2-1、si2-2、si2-3和si3-1、si3-2、si3-3，通過(guò)喂食法進(jìn)行RNA干擾。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了喂食了siRNA24h、48h和72h后MsABCC2和MsABCC3蛋白基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明:喂食si2-124h后，幼蟲(chóng)體內(nèi)MsABCC2蛋白基因的相對(duì)表達(dá)量相比對(duì)照顯著地降低了(P＜0.0

6、5）;喂食si3-1和si3-372h后，幼蟲(chóng)體內(nèi)MsABCC3蛋白基因的相對(duì)表達(dá)量相比對(duì)照顯著地降低。在得到有效的siRNA的片段后，進(jìn)一步檢測(cè)了在沉默MsABCC2和MsABCC3蛋白基因的表達(dá)后，其是否會(huì)影響?zhàn)はx(chóng)對(duì)于Cry1Ac殺蟲(chóng)蛋白的敏感性。結(jié)果表明，黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)MsABCC2的表達(dá)被抑制后取食含有Cry1Ac毒蛋白的人工飼料，7天后其死亡率顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，且未死亡的幼蟲(chóng)其體重也顯著高于對(duì)照。其結(jié)果表明，黏蟲(chóng)對(duì)于C