Hpal蛋白的抗病作用及與AtPIPl;4蛋白互作的光合生理功能.pdf

1、Harpin是由革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌產(chǎn)生的性質(zhì)和功能相似的一類(lèi)蛋白質(zhì)，影響病原菌在寄主植物上的致病性和非寄主植物上的過(guò)敏反應(yīng)（HR）。外施的Harpin能誘導(dǎo)植物抗病、抗蟲(chóng)和抗旱，并且也能促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。本研究中使用的Hpa1xoo是由水稻白葉枯病原細(xì)菌（Xanthomonasoryzaepv.oryzae）產(chǎn)生。水通道蛋白(aquaporin，AQP)是指在生物的細(xì)胞膜上能夠選擇性高效轉(zhuǎn)運(yùn)水分子和一些小分子溶質(zhì)的膜嵌入蛋白，它的主要

2、功能是擔(dān)負(fù)細(xì)胞間或細(xì)胞內(nèi)外水分子和其他小分子溶質(zhì)的輸導(dǎo)。本文著重研究Hpa1xoo與PIP1;4的互作、互作產(chǎn)生的影響以及產(chǎn)生影響的機(jī)制。
　　1.擬南芥轉(zhuǎn)基因植株HETAt和SHETAt的獲得及抗病株系的篩選
　　前人的研究已經(jīng)證明，革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌可以分泌Harpin蛋白，而這種蛋白能夠激活植物的抗病防衛(wèi)反應(yīng)信號(hào)通路，包括對(duì)產(chǎn)生在質(zhì)外體的H2O2信號(hào)進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，但是harpin蛋白在信號(hào)通路中是如何被識(shí)別的以及在質(zhì)外

3、體產(chǎn)生的H2O2是如何參與到防衛(wèi)反應(yīng)中的都還不是很清楚。把Hpa1xoo和融合有質(zhì)外體定位信號(hào)基因(S)的Hpa1xoo(SHpa1xoo)轉(zhuǎn)到擬南芥中，產(chǎn)生了2種轉(zhuǎn)基因的擬南芥植株，我們分別命名為HETAt和SHETAt，HETAt中Hpa1xoo定位于細(xì)胞質(zhì)而SHETAt中Hpa1xoo定位于質(zhì)外體和細(xì)胞質(zhì)。本章的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)兩種植物病原細(xì)菌丁香假單胞番茄致病變種菌株DC3000(PstDC3000)和大白菜軟腐病菌菌株

4、RL4(PccRL4)的抗病性均有所增強(qiáng)。其中HETAt4和SHETAt4是抗病性最好的株系。因此我們選擇這兩個(gè)株系作為后續(xù)研究Hpa1Xoo蛋白和H2O2在轉(zhuǎn)基因植物中的亞細(xì)胞定位以及H2O2是如何參與到防衛(wèi)反應(yīng)過(guò)程中的實(shí)驗(yàn)材料。
　　2.Hpa1xoo與PIP1;4在擬南芥細(xì)胞膜上的互作驗(yàn)證
　　前人的研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入到擬南芥中的Hpa1xoo可以誘導(dǎo)植物防衛(wèi)反應(yīng)同時(shí)促進(jìn)植物生長(zhǎng)。為了進(jìn)一步了解Hpa1xoo的作用機(jī)制，我們

5、實(shí)驗(yàn)室就以Hpa1xoo為誘餌對(duì)擬南芥的cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，從而發(fā)現(xiàn)Hpa1xoo可以與植物水通道蛋白PIP1;4互作。本章就是通過(guò)膜酵母雙雜交技術(shù)（Membraneyeasttwo-hybridsystem，MYTH）、雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)(BimolecularFluorescenceComplementation，BiFC)和熒光染料染色觀察驗(yàn)證Hpa1xoo與PIP1;4的互作并且我們發(fā)現(xiàn)這個(gè)互作過(guò)程是發(fā)生在細(xì)胞膜上的。我們也設(shè)

6、立了一個(gè)對(duì)照組，即ΔNT蛋白處理。ΔNT蛋白是N端缺少了53個(gè)氨基酸的Hpa1xoo蛋白，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)ΔNT蛋白并不能和PIP1;4蛋白發(fā)生互作。
　　3.Hpa1xoo與PIP1;4蛋白的互作促進(jìn)擬南芥的生長(zhǎng)機(jī)制
　　上一章的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了證實(shí)Hpa1xoo與PIP1;4互作，為了進(jìn)一步研究它們的互作會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生什么影響，我們購(gòu)買(mǎi)了7種atpip1;4擬南芥突變體的種子。這些種子都是T2代雜合體，因此我們首先利用卡那霉素和Bas

7、ta抗性篩選出了每種突變體的純合體，并進(jìn)行了分子驗(yàn)證。然后我們用原核表達(dá)的方法得到了Hpa1xoo和ΔNT蛋白并進(jìn)行了純化。用兩種蛋白和水分別處理WT和atpip1;4突變體的種子，觀察了生長(zhǎng)表型并用光合儀測(cè)定了相關(guān)的指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)Hpa1xoo和PIP1;4這兩個(gè)蛋白對(duì)于促進(jìn)植物生長(zhǎng)是缺一不可的。Hpa1xoo處理的WT擬南芥長(zhǎng)勢(shì)最好，而Hpa1xoo處理的atpip1;4擬南芥與ΔNT或水處理的WT和atpip1;4擬南芥生長(zhǎng)表型一致，