建立“三步法”模型研究化學(xué)品對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育形態(tài)學(xué)效應(yīng).pdf

1、斑馬魚(yú)胚胎在化學(xué)品篩選中已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，但傳統(tǒng)的觀察斑馬魚(yú)形態(tài)變化的毒性終點(diǎn)指標(biāo)有限，不能夠完整地表征化學(xué)品對(duì)胚胎的表型效應(yīng)，且傳統(tǒng)的方法具有很強(qiáng)的主觀性，易受到個(gè)人因素的影響而產(chǎn)生誤差。因此，亟需開(kāi)發(fā)一種更加客觀、全面、有效的斑馬魚(yú)胚胎毒性終點(diǎn)指標(biāo)統(tǒng)計(jì)方法。
　　本研究試圖建立一種三步法模型，這種模型可用于定量描述化學(xué)品暴露對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育表型變化的影響：
　　首先，在斑馬魚(yú)魚(yú)體上選取7個(gè)特征點(diǎn)，7個(gè)特征點(diǎn)可以組合成21條

2、線段和105個(gè)角度。我們對(duì)這些指標(biāo)進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算結(jié)果使用單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)照組與處理組進(jìn)行對(duì)比，當(dāng) P＜0.05時(shí)，則認(rèn)為處理組與對(duì)照組相比具有顯著性差異；反之，則無(wú)顯著性差異。
　　其次，以單因素方差分析的結(jié)果為基礎(chǔ)，采用“計(jì)分法”對(duì)包含每個(gè)點(diǎn)的線段和角度進(jìn)行計(jì)分，將差異變化落實(shí)到每個(gè)點(diǎn)上，得到每個(gè)點(diǎn)的差異分值，并對(duì)各個(gè)點(diǎn)的差異分值進(jìn)行排序。
　　最后，根據(jù)每個(gè)點(diǎn)的差異分值的大小，進(jìn)行移軸的工作。選取差異分

3、值最小點(diǎn)作原點(diǎn)，差異分值次小點(diǎn)作X軸正方向上的點(diǎn)，將X軸順時(shí)針旋轉(zhuǎn)90°從而得到Y(jié)軸，最終確定坐標(biāo)軸。在新確立的坐標(biāo)軸中，處理組中的每個(gè)點(diǎn)的坐標(biāo)與對(duì)照組中每個(gè)點(diǎn)的坐標(biāo)相對(duì)比，最終總結(jié)出每個(gè)點(diǎn)的移動(dòng)距離和方向，并對(duì)每個(gè)點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)軌跡做出總結(jié)描述。
　　建立方法后，我們選擇了三（1,3-二氯-2-丙基）磷酸鹽（tris（1,3-dichloro-2-propyl） phosphate（TDCIPP））、1H,1H,2H,2H-全氟-1-

4、己醇（1H,1H,2H,2H-nonafluoro-1-hexanol（4:2 FTOH））和1H,1H,2H,2H-全氟辛醇（1H,1H,2H,2H-perfluorooctanol（6:2 FTOH））三種新型環(huán)境污染物為研究對(duì)象，在斑馬魚(yú)胚胎受精后45 min內(nèi)進(jìn)行暴露，直至96 hpf（受精后96 h）時(shí)進(jìn)行拍照取樣，對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)照片采用上述的三步法模型，對(duì)這三種化學(xué)品進(jìn)行了效應(yīng)分析，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1.化學(xué)品暴露斑

5、馬魚(yú)后魚(yú)體上各點(diǎn)所構(gòu)成的線段和角度的變化
　　結(jié)果顯示，斑馬魚(yú)胚胎經(jīng)三種化學(xué)品（TDCIPP（0.1 mg/L和0.2 mg/L）、4:2FTOH（0.3 mg/L和1 mg/L）、6:2FTOH（0.3 mg/L和1 mg/L））暴露后，其上的七點(diǎn)所構(gòu)成的線段長(zhǎng)度和角度均有顯著性影響。而且，高濃度處理組相對(duì)于對(duì)照組中有顯著性變化的指標(biāo)多于低濃度，且所得結(jié)果具有較好的濃度依賴(lài)性關(guān)系。
　　2.化學(xué)品暴露斑馬魚(yú)后魚(yú)體上各個(gè)點(diǎn)的

6、差異分值變化
　　結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)化學(xué)品暴露后，每個(gè)點(diǎn)的差異分值均有不同程度的變化。其中，三種化學(xué)品處理后，變化最大的點(diǎn)是1點(diǎn)，也就是吻前端的部位。
　　3.化學(xué)品暴露斑馬魚(yú)后魚(yú)體上各個(gè)點(diǎn)的移動(dòng)情況
　　結(jié)果顯示：經(jīng)過(guò)三種化學(xué)品處理后，斑馬魚(yú)的7個(gè)特征點(diǎn)均有不同程度的變化，而且高濃度暴露組變化的幅度顯著高于低濃度暴露組。此外，我們還描述了變化最大的吻前端的部位經(jīng)三種化學(xué)品暴露后的移動(dòng)情況。經(jīng) TDCIPP暴露后，斑馬魚(yú)吻

7、前端部位發(fā)生前移和上移；經(jīng)4:2 FTOH暴露后，斑馬魚(yú)吻前端部位發(fā)生后移和上移；經(jīng)6:2 FTOH暴露后，斑馬魚(yú)吻前端部位同樣發(fā)生前移和上移。
　　4.斑馬魚(yú)魚(yú)體上各個(gè)特征點(diǎn)隨時(shí)間效應(yīng)的變化
　　為了解斑馬魚(yú)形態(tài)隨時(shí)間的變化情況，我們對(duì)正常養(yǎng)殖狀態(tài)下的斑馬魚(yú)幼魚(yú)在72 hpf、96 hpf和120 hpf進(jìn)行拍照取樣，并使用上述方法確定了各個(gè)特征點(diǎn)位置變化的情況。結(jié)果顯示，在時(shí)間效應(yīng)中，斑馬魚(yú)魚(yú)體上變化最大的特征點(diǎn)仍然為吻

8、前端部位，120 hpf時(shí)的變化程度明顯多于96 hpf時(shí)的變化程度，并且隨著斑馬魚(yú)的發(fā)育，斑馬魚(yú)的吻前端部位逐漸前移并且上移。
　　本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：胚胎發(fā)育過(guò)程中，吻前端的位置的移動(dòng)是評(píng)價(jià)環(huán)境毒物的一個(gè)敏感指標(biāo)。本研究建立了一種定量描述斑馬魚(yú)形態(tài)變化的方法，減少了主觀因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，減少了誤差，為斑馬魚(yú)的毒性終點(diǎn)提供了可定量的指標(biāo)，這為以斑馬魚(yú)胚胎為模型，進(jìn)行化學(xué)品毒性篩選方面提供了新的方法，同時(shí)為環(huán)境化學(xué)品的管理提供技術(shù)支撐