采后蘋果與炭疽菌的相互作用及病害控制機理研究.pdf

1、果實采后腐爛是一個全球性問題，已引起世界范圍的極大關(guān)注。蘋果炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides）是蘋果上的主要病害，引致蘋果采后腐爛嚴重。本文從從保護生態(tài)環(huán)境和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的角度出發(fā)，以蘋果采后炭疽病為研究對象，利用物理的、化學(xué)的、生物的和農(nóng)業(yè)的無污染防除技術(shù)及分子鑒定診斷技術(shù)，逐步組建蘋果采后炭疽病可持續(xù)控制的病害防御體系。分別開展了蘋果炭疽菌生物學(xué)特性研究，利用離子束生物工程和磁生物工程技術(shù)誘變的

2、枯草芽孢桿菌和蘋果炭疽菌低毒性菌株防治蘋果采后炭疽病的控病效果和作用機制研究，與環(huán)境相容好、高效、低毒、使用安全、對倉儲蘋果無污染，不影響外觀和風(fēng)味的新農(nóng)藥、新劑型和使用技術(shù)研究，品種抗病性鑒定及不同蘋果品種對炭疽病菌的抗性生理生化機制和蘋果炭疽菌致病機制研究，蘋果炭疽菌的快速分子鑒定和檢測及蘋果炭疽病的早期診斷。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1．蘋果炭疽菌生物學(xué)特性研究結(jié)果表明，蘋果采后炭疽菌營養(yǎng)生長的溫度范圍為1

3、0℃～35℃，最適溫為28℃。菌絲致死溫度為40℃5d，分生孢子在40℃下培養(yǎng)11天后，仍具有萌發(fā)能力。分生孢子萌發(fā)以25℃最佳，芽管伸長以30℃最適。液體培養(yǎng)，30℃時菌絲生長量最大。RH<80％時菌絲不能生長，RH>80％時菌絲生長速率差異不大。分生孢子的萌發(fā)對濕度要求嚴格，僅在自由水和有水膜的情況下萌發(fā)。pH為3～11范圍內(nèi)均可營養(yǎng)生長，pH2～11范圍內(nèi)孢子均可萌發(fā)。液體培養(yǎng)條件下，適合營養(yǎng)生長的pH范圍為4～9，且在此范圍差異

4、不明顯。在一定范圍內(nèi)，酸性條件下孢子萌發(fā)率較堿性條件下萌發(fā)率高。在一定溫、濕度條件下，蘋果貯藏過程中炭疽病的發(fā)展曲線為不對稱S型，用岡珀茨模型（Gompertz model）進行曲線擬合，模型擬合度達到極顯著水平。
　　 2．蘋果炭疽菌的分子鑒定和檢測結(jié)果表明，兩株病原菌Cg-1和Cg-2的ITS序列相似性達100％；二者與膠孢炭疽菌的相似性極高，達99.8％；與炭疽菌其它7個種的相似性相對較低，只有83.1％-98.5％；與不

5、同屬的鐮刀菌相似性最低，為68.9％。因此可以明確蘋果炭疽菌應(yīng)屬于膠孢炭疽菌。經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)，蘋果炭疽菌的18S rDNA3’端比GenBank已登陸的2個膠孢炭疽菌多出一段379 bp的序列，將去除379 bp的蘋果炭疽菌rDNA序列與其它膠孢炭疽菌相比，序列相似性高達96.6％。根據(jù)這一特有片段設(shè)計特異性引物，結(jié)果儀能從蘋果炭疽菌中擴增出1232 bp的特異性條帶。用蘋果炭疽菌接種離體蘋果，以接種發(fā)病的病組織總DNA為模板，利用引物

6、CgF1/ITS4進行PCR擴增，同樣可以擴增出1232 bp的特異性條帶，而健康蘋果組織DNA中未能擴增出任何條帶，表明該方法可用于蘋果炭疽菌的鑒定和快速檢測。
　　 3．蘋果采后炭疽病的化學(xué)防治及控病機理研究結(jié)果表明，丙環(huán)唑、苯氧菌酯、撲海因、苯醚甲環(huán)唑和氟硅唑抑菌作用較強，代森錳鋅抑菌作用較弱。藥劑間對孢子萌發(fā)率和芽管伸長抑制率差異顯著，其中撲海因、氟硅唑?qū)︽咦用劝l(fā)有抑制作用，抑制率分別為42.6％、48.3％。代森錳鋅、

7、丙環(huán)唑幾乎無抑制孢子萌發(fā)的作用，孢子萌發(fā)率為99.3％、98.2％。但丙環(huán)唑?qū)ρ抗苌扉L能較好的抑制。活體試驗表明：丙環(huán)唑、苯氧菌酯、嘧菌酯防效較好，其中丙環(huán)唑的防效達到100％。藥劑不同作用方式的試驗結(jié)果說明：浸果處理明顯好于噴霧?；靹┮远嗑`+代森錳鋅（9：1，7：3）抑菌效果為最好，抑制菌絲生長的共毒系數(shù)達到692.426、593.020?；铙w試驗表明：混劑以多菌靈+代森錳鋅（9：1、7：3）防效為最好。
　　 4．鈣鹽對蘋

8、果炭疽病菌的抑制作用結(jié)果表明，CaCl2、Ca（NO3）2·4H2O和Ca（H2PO4）2對菌絲生長有一定的影響。Ca2+濃度為900μg/ml時，對菌絲生長影響較小，Ca2+濃度高于1000μg/ml時能較好地抑制菌絲生長，Ca2+濃度低于600μg/ml時有促進菌絲生長的趨勢。CaC12、Ca（NO3）2·4H2O和Ca，（H2PO4）2不能抑制分生孢子的萌發(fā)。鈣鹽對芽管伸長的抑制作用，當Ca2+濃度大于900μg/ml時Ca（NO

9、3）2·4H2O、CaCl2和Ca（H2PO4）2的抑制率分別為13.10％、45.75％和46.09％；當濃度繼續(xù)增大時，濃度處理之間的抑制作用差異不顯著。當濃度小于600μg/ml時，對芽管的伸長反而有一定的促進作用。
　　 5．蘋果采后炭疽病生物防治及控病機理的研究結(jié)果表明，利用低能氮離子對枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）進行注入誘變，通過平板初篩出6株對蘋果炭疽病菌有較好抑菌作用的菌株，經(jīng)蘋果果實活體測

10、定從中篩選對蘋果炭疽病有較好控病作用的菌株，從接種方式及病害發(fā)生的時間看，先接突變菌株的各處理發(fā)病時間均晚于先接病菌的處理，明顯推遲發(fā)病時間，表現(xiàn)出較強的保護作用，低溫儲藏對病害發(fā)生的抑制作用更明顯。以先接突變菌株后控病效果較好的菌株按儲藏溫度的不同分為：室溫下的防治效果較好的菌株為BS80-6，14d時的防效為33.28％；低溫條件下BS100-1、BS100-6、BS80-6、BS120-8的效果較好，30d時的防效分別為98.36

11、％、95.36％、95.52％、93.52％；變溫下各菌株BS80-1、BS100-1、BS120-8的效果最好，30d的防效分別為84.59％、75.15％、72.40％。突變菌株三種處理液對病菌孢子萌發(fā)抑制作用以活菌液的效果最好，其次是濾液，高壓滅菌液的效果最差。經(jīng)平板濾紙片法和液體共培養(yǎng)法測定突變菌株對病菌菌絲的破壞作用的顯微鏡觀察結(jié)果表明，BS80-6菌株產(chǎn)生的抗生物質(zhì)抑制孢子萌發(fā)、使蘋果炭疽病菌菌絲體畸形，原生質(zhì)凝集，泡囊化。

12、同時對寄主防御酶（POD、PPO、PAL）活性的研究表明突變菌株能誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗病性。
　　 6．熱處理與藥劑相結(jié)合、枯草芽孢桿菌濾液分別與Ca2+和苯氧菌酯配合使用的抑菌作用結(jié)果表明，熱處理與藥劑結(jié)合則能更好地控制病害，丙環(huán)唑和禾紋清在40℃作用下的效果最好，藥劑與熱處理相結(jié)合的防效大于藥劑單獨作用的防效?？莶菅挎邨U菌的濾液分別與Ca2+和苯氧菌酯配合使用的抑菌效果明顯好于單獨使用Ca2+和苯氧菌酯配的效果。其中濾液與苯氧菌酯

13、的配合使用的效果最佳，對蘋果炭疽病菌的抑制效果達到58.2％。濾液與Ca2+混合使用抑制率達到32.9％，比單獨使用Ca2+的抑制效果提高了27.8％。濾液和Ca2+、苯氧菌酯結(jié)合使用在蘋果果實上的控制效果明顯好于單獨使用Ca2+、苯氧菌酯的效果。濾液與Ca2+結(jié)合控制效果提高了11.7％。
　　 7．蘋果炭疽菌低毒性菌株篩選及控病作用的研究結(jié)果表明，離子注入C100-2-5低毒株和磁場處理C0.25-1-2低毒株對蘋果有較好的

14、保護作用。離子誘變的低毒性菌株對蘋果炭疽病的控制效果達到55％左右。低毒性與強毒性菌株按不同比例混合接種蘋果的控制效果之間的差異顯著性不明顯，但都與單接種的強毒菌株達到顯著差異。菌株的毒性不同，引起果實體內(nèi)酶的活性變化也略有不同。測定低毒菌株rDNA序列，結(jié)果表明，引物CgF/CgR均可以擴增出3156 bp的片段，且此段序列幾乎沒有發(fā)生變異。30條隨機引物進行RAPD擴增，結(jié)果表明低毒菌株與正常菌株RAPD擴增多態(tài)性無明顯區(qū)別，未能發(fā)

15、現(xiàn)差異性，ISSR擴增結(jié)果表明低毒菌株與正常菌株無明顯區(qū)別，20條引物未能發(fā)現(xiàn)差異性。
　　 8．采后蘋果與炭疽菌相互作用及生理機制研究結(jié)果表明，蘋果對炭疽菌抗性品種間差異極顯著（P=0.01），根據(jù)發(fā)病程度，其抗性可以分為四類：紅富士感?。⊿）；嘎啦、喬納金次之，中感（MS）；遼伏中抗（MR）；黃金帥果實發(fā)生過敏性壞死反應(yīng)，抗病（R）。初步明確了聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）和羧甲基纖維素酶（Cx）在該菌侵染蘋果過程中起關(guān)鍵作用

16、。蘋果果實接種炭疽菌后β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性都被誘導(dǎo)提高，幾丁質(zhì)酶活性增幅高于β-1，3-葡聚糖酶，分別是對照的3-11倍和2-6倍。蘋果感染炭疽菌后，主要防御酶過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性變化與品種抗性有明顯相關(guān)性，表現(xiàn)出相似的趨勢，抗病品種酶活始終高于感病和中感品種，接種前差異不顯著，接種后差異顯著，抗病品種酶活性升高幅度大，高峰出現(xiàn)的早，且一直保持在較高的水平。接種前，與品