種子特異元件分析及AT2S3啟動子在抗氧化基因工程中的應(yīng)用.pdf

1、盡管基因表達的最終產(chǎn)物受到多級水平調(diào)控，啟動子在決定基因的時間和空間表達模式以及轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)揮著非常重要的作用。目前對啟動子的研究多是局限于個別順式作用元件的鑒定與功能分析，從基因組水平對這些調(diào)控元件進行分析的報道并不多見。
　　 組成型啟動子在轉(zhuǎn)基因植物的研究中得到了廣泛運用，而且多數(shù)情況下帶來了巨大的效益，然而在所有組織中持續(xù)高效表達目的基因也給植物生長帶來了不利影響。組織特異啟動子作為一類專一性啟動子，能指導(dǎo)外源基因在植物

2、發(fā)育過程中某一特定時空表達，它不僅能使目的基因的表達產(chǎn)物在一定空間積累，增加區(qū)域表達量，而且也避免了植物營養(yǎng)的浪費。此外，植物的種子與人類的生產(chǎn)生活關(guān)系非常密切，因此也成為植物基因工程中進行改良的重要目標材料。所以，利用種子特異性啟動子控制目的基因在種子中特異表達具有重要的理論和實踐意義。
　　 在過去的研究中，通過超表達SOD或其他活性氧清除酶來提高植物抗脅迫能力的例子已經(jīng)屢見不鮮。絕大多數(shù)情況下，這些轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出了較野生

3、型提高的抗臭氧、凍害、鹽脅迫或者百草枯的能力。然而這些研究多是利用組成型啟動子35S來驅(qū)動僅僅一個抗氧化酶過量表達，通過組織特異啟動子驅(qū)動多個抗氧化酶來提高植物抗逆性的研究仍然很少。
　　 本課題首先以生物信息學(xué)為手段，檢索四個種子特異元件RY，Prolamm-box（PROL），GCN4和AACA在擬南芥和水稻基因組上的分布，進而分析這些元件在基因組中ATG上游的存在位置、元件組合中的元件間距特點以及對鏈的偏好性等，再結(jié)合網(wǎng)絡(luò)

4、資源（Gencvestigator）從擬南芥中找到30個可能的種子特異基因，從中選取了一個AT2S3并對其啟動子的表達模式進行詳細分析，最后再利用該啟動子驅(qū)動抗氧化基因在擬南芥種子中特異地超表達。主要研究結(jié)果如下：
　　 （1）首先檢索四個種子特異元件RY、PROL、GCN4和AACA在擬南芥和水稻基因組啟動子上出現(xiàn)的頻率。從物種上看，以每10，000個基因所出現(xiàn)的元件數(shù)目進行比較，RY在水稻和擬南芥基因組中出現(xiàn)的數(shù)目相差不多，

5、PROL、GCN4和AACA在水稻中的出現(xiàn)頻率分別是在擬南芥中的出現(xiàn)頻率的2.07倍、2.84倍和1.97倍；無論是在哪個物種的基因組中，四個元件在正鏈和負鏈的存在數(shù)目均相差不多，沒有方向的偏好性；在元件之間進行比較發(fā)現(xiàn)，PROL和AACA在兩個物種中的出現(xiàn)頻率均遠遠多于另外兩個元件。
　　 （2）通過分析四個元件與ATG的距離發(fā)現(xiàn)，RY和AACA在水稻和擬南芥的基因組中ATG上游總體分布比較均勻；GCN4和PROL在擬南芥基因

6、組上的分布總體上也比較均勻，但是在水稻基因組上多集中在距離ATG較近的位置，0-300bp之間出現(xiàn)的元件個數(shù)明顯高于其他位置。
　　 （3）由相同或不同元件組成的組合在擬南芥和水稻基因組上的分布絕大部分都有這樣的特點：兩元件間距為0-100bp時相應(yīng)的組合數(shù)最多，隨間距的增大元件組合數(shù)越來越少；元件組合在兩種基因組上的分布都存在鏈的偏好性/方向性。
　　 （4）結(jié)合基因組文件分析結(jié)果和芯片數(shù)據(jù)（Genevestigato

7、r），我們在擬南芥中找到了30個啟動子中包含RY元件、因而可能進行種子特異表達的基因，從中挑選了編碼擬南芥種子貯藏蛋白albumin的基因家族成員之一AT2S3（AT4G27160）做了進一步分析，半定量RT-PCR表明該基因的表達模式與芯片結(jié)果一致，只在種子和果夾中有信號，在別的組織中均不表達。
　　 （5）利用GUS報告基因、通過GUS組織化學(xué)染色和GUS活性測定證明AT2S3啟動子能驅(qū)動下游基因在種子相關(guān)器官（包括果夾、成

8、熟種子和幼苗）中特異、高效表達；啟動子的序列缺失分析表明，在G-box存在時，正是RY元件決定了AT2S3啟動子的種子特異性。
　　 （6）為了特異增強種子的抗氧化脅迫能力，我們利用AT2S3啟動子分別驅(qū)動錳-超氧化物歧化酶基因MSD1，過氧化氫酶基因CAT1和維生素E生物合成中的關(guān)鍵酶尿黑酸植基轉(zhuǎn)移酶基因HPT1在擬南芥種子中過量表達。選取表達量最高的株系進行雜交，得到雙價和三價轉(zhuǎn)基因株系。酶活性測定表明Mn-SOD活性、CA

9、T活性以及γ-生育酚含量在其相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因種子中都顯著提高。
　　 （7）在種子萌發(fā)和幼苗生長早期，At2S3：：MSD、M7/C9和M7/C9/H3對甲基紫精（MV）或過氧化氫（H2O2）導(dǎo)致的氧化脅迫均表現(xiàn)出比野生型顯著提高的耐性，At2S3：：CAT對H2O2脅迫也表現(xiàn)出較高的抗性；酶活性測定結(jié)果表明Mn-SOD和CAT活性的同時增加對轉(zhuǎn)基因擬南芥在發(fā)育早期抗氧化能力的提高是至關(guān)重要的；超表達抗氧化基因并沒有改變種子的產(chǎn)量和