雞新城疫抗體檢測(cè)試紙條的研制及初步應(yīng)用.pdf

1、雞新城疫(Newcastledisease，ND)是由副粘病毒科腮腺炎病毒屬的1型副粘病毒（Paramyxovirus）新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)引起的一種極易傳染的毀滅性疾病，該疾病嚴(yán)重地阻礙了世界養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。
　　 檢測(cè)雞群的免疫水平和評(píng)價(jià)雞群的免疫狀況對(duì)于該病的控制有著重要的意義。而目前，新城疫抗體檢測(cè)技術(shù)主要局限于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，在臨床應(yīng)用時(shí)有一定的局限性。本研究利用原核表達(dá)血凝素神經(jīng)

2、氨酸酶蛋白，結(jié)合膠體金免疫層析技術(shù)，建立了雞新城疫病毒抗體快速檢測(cè)方法，取得以下研究結(jié)果：
　　 1.新城疫血凝素神經(jīng)氨酸酶蛋白的原核表達(dá)及純化用本實(shí)驗(yàn)室保存的NDVLaSota株通過雞胚傳代，收取尿囊液后提取病毒RNA，分別設(shè)計(jì)帶有BamHI和HindⅢ酶切位點(diǎn)的兩對(duì)引物，利用RT-PCR擴(kuò)增出HN基因的全長(zhǎng)和去信號(hào)肽和跨膜區(qū)序列的片段，將兩種擴(kuò)增產(chǎn)物分別克隆進(jìn)pGEX-KG載體，成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pKG-HN和pKG-H

3、Nde-sp，測(cè)序后，兩條基因大小分別為1734bp和1593bp，擴(kuò)增序列與GenBank上報(bào)道的LaSota株的基因核苷酸序列的同源性為99％。將構(gòu)建好的pKG-HN和pKG-HNde-sp質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)，誘導(dǎo)后，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，重組表達(dá)的蛋白分子量分別約為89KD和80KD。經(jīng)過對(duì)表達(dá)蛋白的條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示，pKG-HNdc-sp在溫度為37℃、IPTG濃度為1‰和誘導(dǎo)5h的表達(dá)量

4、最高，Western-Blot分析表明，表達(dá)蛋白有較好的免疫學(xué)活性。
　　 2.雞新城疫病毒抗體快速檢測(cè)試紙條的建立用檸檬酸三鈉還原法制備20nm的膠體金，用鼠抗雞IgGFc單抗標(biāo)記，標(biāo)記的最佳pH為8.0，最佳標(biāo)記量為9.6μL1.0mg/mL。以金標(biāo)鼠抗雞IgGFc單抗為探針，以兔抗鼠IgG作為質(zhì)控線，以純化的HN蛋白作為檢測(cè)線的捕獲試劑，初步建立了能檢測(cè)雞新城疫抗體的膠體金快速檢測(cè)試紙條。兔抗鼠IgG的最佳噴膜濃度為1.0

5、mg/mL，HN表達(dá)蛋白的最佳噴膜濃度為1.1mg/mL。該試紙條與傳染性法氏囊、傳染性支氣管炎、禽流感H9亞型、禽流感H5亞型、雞毒霉形體等陽性血清和無特定病原體雞陰性血清反應(yīng)均為陰性；靈敏度與血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果一致。該方法操作簡(jiǎn)單，特異性強(qiáng)，靈敏度高，可用于雞新城疫血清抗體水平的檢測(cè)。
　　 3.雞新城疫抗體快速檢測(cè)試紙條的初步應(yīng)用用本試驗(yàn)制備的雞新城疫抗體快速檢測(cè)試劑盒進(jìn)行臨床應(yīng)用，檢測(cè)240份血清，其中試紙條檢測(cè)出陽性血清