小麥漸滲系山融3號鹽脅迫應答基因TaHB30和TaCHP的功能鑒定.pdf

1、小麥作為世界上分布最廣、種植面積最大、加工制品最為豐富的糧食作物之一，其農(nóng)業(yè)地位的重要性不可忽視。然而隨著水資源的日益匱乏及土地荒漠化的日趨嚴重，非生物脅迫如高鹽、干旱等對小麥品質(zhì)的提高及產(chǎn)量的增加形成了較大的負面影響。加之非生物脅迫應答是由多基因控制的復雜性狀，涉及到細胞防御、離子平衡、次生代謝以及能量代謝等諸多方面。且小麥作為異源六倍體，同擬南芥等模式植物相比，耐鹽機制研究的復雜性相應增加，生長周期也相對延長，因此，即便與水稻、玉米

2、等其他作物相比，小麥逆境分子機理的研究仍然進展緩慢。
　　 由于小麥屬于甜土植物，自身耐鹽能力不強，而其野生近緣物種則是抗逆改良的重要基因庫，可作為基因工程和細胞工程技術培育耐逆新品種的重要基因源。本實驗利用不對稱體細胞雜交漸滲技術，獲得了鹽敏感小麥品種濟南177（Triticumaestivum2n=42，JN177）與強耐鹽性小麥近緣屬長穗偃麥草(Thinopyrumponticum，2n=70)的漸滲系抗鹽新品種山融3號(

3、SR3)。山融3號的耐鹽指數(shù)及各項生理生化指標均明顯優(yōu)于親本小麥JN177，其耐鹽性由主效基因和微效基因共同控制。
　　 在本實驗前期對SR3全基因組芯片和蛋白組分析的基礎上，我們發(fā)現(xiàn)兩個受脅迫表達變化的基因，結合SR3鹽脅迫cDNA全長文庫和RACE手段，獲得基因全長。下面分別對兩個基因進行功能驗證，主要的研究內(nèi)容及結果包括:
　　 1.小麥耐鹽相關基因TaHB30的克隆及初步功能分析
　　 通過分析SR3鹽脅

4、迫cDNA全長文庫基因，發(fā)現(xiàn)了一個受鹽脅迫表達顯著上調(diào)的基因，依據(jù)文庫編號將其命名為TaHB30。在對其編碼的蛋白序列進行Blast分析時，發(fā)現(xiàn)該基因含有Cu/Zn超氧化物歧化酶典型的激活位點，并包含有4個Cu2+結合位點和4個Zn2+結合位點，將其歸類于Cu/Zn超氧化物歧化酶大類。
　　 200mMNaCl處理條件下，在SR3及其親本JN177根葉中總體為上調(diào)的表達趨勢;10mM過氧化氫處理后，根部的變化情況SR3同JN17

5、7較為一致，都呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的波動變化。葉中SR3仍為先下調(diào)后上調(diào)的趨勢，而JN177則是下調(diào)表達。在這些處理中，TaHB30在SR3中的表達量均高于JN177。
　　 由于Cu/Zn超氧化物歧化酶在植物細胞中分布比較廣泛，為確定TaHB30的功能作用部位，對基因表達產(chǎn)物進行亞細胞定位。通過該蛋白偶聯(lián)GFP，基因槍法轉化洋蔥表皮細胞和PEG誘導擬南芥原生質(zhì)體，GFP熒光信號一致出現(xiàn)在細胞質(zhì)與細胞核中，表明該基因產(chǎn)物主要在胞質(zhì)同

6、核中起作用。
　　 構建TaHB30表達載體并分別轉化擬南芥和小麥，對擬南芥過表達轉基因株系(OE系)在多種逆境脅迫下的表型進行分析。在對照條件下，OE系和對照株系生長狀況正常，沒有明顯差異;在不同濃度的Mannitol處理下，OE系與對照株系差異也不明顯。但當NaCl濃度增加到50mM以后，OE系的生長狀態(tài)明顯好于對照株系，主根根長同對照植株相比較長，側根的生長也比對照株系發(fā)達。在添加H202的培養(yǎng)基上，OE系的生長狀況也明顯

7、優(yōu)于對照株系。隨后進行了不同種類激素，包括IAA、JA、ABA與GA3的處理，在對照和轉基因株系中都未發(fā)現(xiàn)表型的明顯差異。初步推測，TaHB30通過增強ROS途徑促進OE系的耐鹽能力，同相關的植物激素信號通路沒有交匯。利用擬南芥突變體驗證該基因功能，將TaHB30轉化擬南芥突變體，發(fā)現(xiàn)TaHB30過表達擬南芥突變體在正常條件下比對照系的根短，而在NaCl和H2O2的處理下這種根長度的差異消除，推測與該基因調(diào)控擬南芥內(nèi)源ROS的信號途徑有

8、關。
　　 RT-PCR和realtimePCR結果顯示，正常生長條件下，擬南芥過表達株系(OE1，OE2)本底的超氧化物歧化酶(SOD)編碼基因比對照株系表達量增高;而其下游多個ROS清除酶編碼基因表達上調(diào):谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)表達量的增幅最為顯著，其他如過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)分別編碼的2個基因在OE系的表達量同對照也具有顯著差異。值得注意的是:位于ROS途徑上游、與H2O2產(chǎn)生密切相關的N

9、ADPH氧化酶編碼基因RBOH-D，RBOH-F的表達明顯提高，并且在同時含有H2O2和NADPH氧化酶抑制劑的培養(yǎng)基上，OE系的生長狀況不再優(yōu)于對照株系;在正常條件下，TaHB30過表達擬南芥突變體的RBOH-D基因表達變化不顯著，而GPX基因的表達量對照系比較明顯上調(diào)。以上結果表明:小麥Cu/Zn超氧化物歧化酶基因TaHB30通過調(diào)控NADPH氧化酶的變化，進入ROS信號途徑而在耐鹽中起作用。
　　 進一步測定了OE系及空載

10、體對照的ROS相關酶活性，結果表明:OE系的ROS清除酶系統(tǒng)中總超氧化物歧化酶(SOD)和Cu/Zn超氧化物歧化酶的酶活力都較對照提高;過氧化氫酶(CAT)的酶活力約為對照的1.5-2倍;谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)的酶活力約為對照的1.3倍。而ROS的產(chǎn)生酶-非特異性NADPH氧化酶(NOX)活性也在過表達擬南芥中明顯升高（1.6倍）;DAB染色顯示，TaHB30過表達株系中H2O2含量明顯低于對照植株;而NBT染色后，超氧陰離子的含

11、量高于對照植株。
　　 以上結果表明:TaHB30通過調(diào)節(jié)ROS信號轉導系統(tǒng)提高植物耐鹽性。
　　 2.小麥耐鹽相關基因TaCHP的功能分析
　　 通過本實驗前期工作，發(fā)現(xiàn)了一個鹽脅迫應答新基因TaCHP，編碼一個CHP-rich（半胱氨酸，組氨酸和脯氨酸豐富）的鋅指蛋白家族基因。TaCHP含有能特異性結合磷脂信號分子甘油二酯(DAG)的C1結構域和可能的激酶結構域，含有該結構域的蛋白質(zhì)大多具有蛋白激酶（定位細胞

12、膜）和/或轉錄調(diào)控因子（定位細胞核）活性。本研究發(fā)現(xiàn)，TaCHP定位在細胞膜和細胞核，推測是一個具有蛋白激酶和轉錄因子雙重功能的抗逆相關重要蛋白。體外PKC激酶活性測定表明，TaCHP表達蛋白無激酶活性。轉錄激活活性分析發(fā)現(xiàn)C'端兩個C1結構域及TaCHP全長具有轉錄激活活性，表明該基因可能作為一個轉錄因子行使功能。
　　 進行TaCHP脅迫表達模式及其定位分析，發(fā)現(xiàn)TaCHP主要在三葉期的小麥根部表達，原位雜交結果表明轉錄產(chǎn)物

13、定位于根尖的皮層和分生組織細胞內(nèi)。TaCHP表達量在SR3中比親本JN177高，通過NaCl，干旱，ABA等處理后，二者都呈現(xiàn)下調(diào)趨勢。但是，SR3總體表達量均維持在比JN177明顯高的水平。
　　 將TaCHP轉化鹽敏感小麥濟南17，小麥的耐鹽、抗旱、抗氧化能力及相關生理生化指標都明顯提高，證明了該基因的抗逆功能。構建了TaCHP過表達(BS、A5)擬南芥株系，進一步研究該基因可能的作用機制。除了耐鹽性以外，擬南芥對H2O2和

14、ABA的耐受性也有所增加。在鹽處理下，過表達系中一部分脅迫響應基因(AtCBF3，AtDREB2A，AtABI2和AtABI1)的表達量升高，而ABA合成基因AtAAO3，AtABA2和AtMYB15的表達量降低。Real-timePCR顯示轉基因擬南芥BS、A5的AtRBOHD表達量平均增幅達7倍，其編碼的NADPH氧化酶是ROS產(chǎn)生的重要組成部分，而活性氧清除酶CAT和APX編碼基因AtCAT2、AtAPX2在擬南芥過表達株系中被誘