奶牛隱性乳腺炎免疫傳感器診斷技術的研究.pdf

1、奶牛乳腺炎是嚴重危害奶牛健康的主要疾病之一,包括臨床型乳腺炎和隱性乳腺炎兩種類型。臨床型乳腺炎具有明顯的臨床癥狀,診斷較為容易;隱性乳腺炎則缺乏臨床癥狀,必須借助實驗室手段才能進行診斷。長期以來,臨床上建立隱性乳腺炎的診斷方法主要依賴于直接或間接計數(shù)牛奶體細胞(somatic cell)或?qū)θ橹M行微生物培養(yǎng)。近年來,通過檢測牛奶中的急性時相蛋白(acute phase protein, APP)以建立奶牛隱性乳腺炎的診斷逐漸受到重視。

2、結合珠蛋白(haptoglobin, Hp)是牛的一種主要APP,該物質(zhì)主要由肝臟合成,在正常牛奶中含量極低以致無法檢出。在奶牛乳腺炎發(fā)生過程中,由于血-乳屏障的通透性升高,Hp可通過血-乳屏障進入到牛奶中。因此,牛奶中Hp含量升高被認為是奶牛發(fā)生乳腺炎的標志之一。盡管目前已有用于檢測Hp的商品化ELISA檢測試劑盒,但其檢測過程耗時較長、自動化程度低,不適應現(xiàn)場檢測的要求。免疫傳感器檢測技術是近年來發(fā)展起來的一種新型檢測技術,其基本檢

3、測原理與ELISA方法相似,但可將抗原-抗體反應信號通過電化學傳感裝置進行放大和輸出,從而實現(xiàn)快速、靈敏和自動化檢測。
　　本研究的目的在于構建檢測牛奶中Hp含量的免疫傳感器,以期為診斷奶牛隱性乳腺炎提供新的技術和方法。本研究內(nèi)容分為三部分。第一部分,在普魯士藍/鄰苯二胺/納米金修飾電極上組裝牛結合珠蛋白抗體的電流型免疫傳感器的研制。以電化學三電極系統(tǒng)為基本裝置,以金電極為工作電極,鉑絲電極為對電極,Ag/AgCl電極為參比電極,

4、通過電沉積方法將普魯士藍(PB)沉積于金電極表面,在其上電聚合鄰苯二胺(o-PDA)以防止PB滲漏,并依次將納米金顆粒和抗牛Hp抗體(濃度為5.0 mg/L)組裝到金電極表面,制得免疫傳感器。該傳感器工作電極在Hp抗原溶液中的最適孵育時間為15min,掃描底液最適pH值為6-7。在最適檢測條件下,該傳感器對Hp的檢測靈敏度在5-10mg/L之間。第二部分,在L-半胱氨酸/納米金修飾電極上固定結合珠蛋白抗體的免疫傳感器的研究。以三電極系統(tǒng)

5、中的金電極為工作電極,采用層層自組裝技術將L-半胱氨酸、納米金顆粒和抗牛Hp(濃度為5.0 mg/L)抗體依次組裝在工作電極上,制成免疫傳感器。制成的免疫傳感器對Hp的線性檢測范圍為15-100mg/L,最低檢測限為0.63mg/L。分別采用該傳感器和ELISA檢測試劑盒對隱性乳腺炎患牛乳樣中Hp含量進行檢測,結果表明該兩種方法的檢測結果之間無顯著差異(P＞0.05)。第三部分,免疫傳感器診斷法與常用隱性乳腺炎診斷法的比較。在杭州市近郊

6、某奶牛場選取20頭臨床健康奶牛作為實驗對象。隨機選取每頭奶牛的前后兩個乳區(qū)采集奶樣,采用乳汁病原菌培養(yǎng)法、HMT法、SCC法以及本研究構建的L-半胱氨酸/納米金/Hp抗體免疫傳感器診斷隱性乳腺炎。分別以細菌學檢測陽性、HMT檢測陽性(評分等級為1-3)、SCC≥50×104個/ml和Hp≥3.9mg/L為隱性乳腺炎的診斷標準。對各種方法的診斷結果采用卡方檢驗進行差異顯著性分析,并采用Kappa檢驗進行診斷符合率分析?？ǚ綑z驗結果表明,傳

7、感器診斷方法得出的隱性乳腺炎陽性和陰性診斷結果與SCC法診斷結果之間差異顯著(P＜0.05),但與乳汁病原菌培養(yǎng)法和HMT法診斷結果之間差異不顯著(P＞0.05)。Kappa檢驗結果亦表明,傳感器檢測方法與SCC法診斷結果符合率較低(Kappa＜0.40),但與細菌學檢測方法和HMT檢測方法得到的診斷結果相符合(Kappa＞0.40).上述結果表明,本研究構建的L-半胱氨酸/納米金/Hp免疫傳感器可用于診斷奶牛隱性乳腺炎。
　　綜