識(shí)別構(gòu)象型抗原表位抗狂犬病NP單抗研究.pdf

1、狂犬病是一種古老的能引起人和動(dòng)物嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變的傳染性疾病，癥狀一旦出現(xiàn)則造成致命的腦脊髓炎，無(wú)法治療，接種疫苗是防治本病的唯一措施。為促進(jìn)對(duì)狂犬病的檢測(cè)、預(yù)防和診斷，以及對(duì)狂犬病病毒蛋白的結(jié)構(gòu)、抗原變異、毒力、在病毒侵染、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制中的功能的研究，我們將經(jīng)蔗糖密度梯度純化后的狂犬病病毒L16株作為抗原制備了抗狂犬病病毒的單克隆抗體，并對(duì)其中部分抗體做了抗原表位的鑒定。本研究分為三個(gè)部分：
　　 第一部分，狂犬病病毒的培

2、養(yǎng)和純化。本實(shí)驗(yàn)以狂犬病病毒L16毒株接種BSR細(xì)胞，感染96小時(shí)后，收集細(xì)胞上清，去除細(xì)胞碎片后通過蔗糖密度梯度離心進(jìn)行純化，通過10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離鑒定純化的病毒蛋白。結(jié)果提示培養(yǎng)的細(xì)胞上清中的病毒得到了很好的富集和純化，其病毒蛋白含量達(dá)到1.0 mg/mL。這為進(jìn)一步制備單克隆抗體奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分，狂犬病病毒L16單克隆抗體的制備和鑒定。以β-丙內(nèi)酯滅活純化的L16病毒為抗原，免疫Balb/c小

3、鼠，經(jīng)初步免疫和加強(qiáng)免疫后，取骨髓瘤(SP/20)細(xì)胞和小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，并建立ELISA以及免疫熒光篩選體系，通過篩選得到了很多抗不同蛋白陽(yáng)性雜交瘤株。本研究對(duì)其中4個(gè)單抗(mAb/N40、mAb/N42、mAb/N46和mAb/P49)所對(duì)應(yīng)的抗原蛋白進(jìn)行了進(jìn)一步研究和探討。首先將狂犬病病毒核蛋白和磷蛋白真核表達(dá)的載體通過牛痘病毒(Vaccinia virus)的輔助在BSR細(xì)胞中表達(dá)，再利用篩選出的4個(gè)單抗mAb/N40、m

4、Ab/N42、mAb/N46和mAb/P49進(jìn)行免疫熒光法檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單抗(mAb/N40、mAb/N42、mAb/N46)均識(shí)別核(N)蛋白，而另一個(gè)單抗(mAb/P49)識(shí)別磷(P)蛋白。對(duì)這四個(gè)抗體進(jìn)行免疫印跡的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MAb/N42和mAb/P49能識(shí)別變性的對(duì)應(yīng)抗原蛋白，提示這兩個(gè)單抗識(shí)別線性抗原表位；而mAb/N40和mAb/N46不能識(shí)別變性的N蛋白，提示這兩個(gè)單抗識(shí)別是構(gòu)象型抗原表位。
　　 第三部分，抗N蛋白

5、單克隆抗體的抗原表位定位以及抗體的應(yīng)用。為了確定上述三個(gè)抗N蛋白的單克隆抗體的抗原表位，我們構(gòu)建了不同的氨基端和羧基端缺失突變型的N蛋白的質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄和翻譯，并用上述三個(gè)抗N單克隆抗體作免疫沉淀和免疫雜交。這些免疫沉淀的分析發(fā)現(xiàn)mAb/N40識(shí)別的抗原表位位于126-284氨基酸的位置，而mAb/N42和mAb/N46識(shí)別的抗原表位位于284-325氨基酸的位置。這些結(jié)果提示雖MAb/N40和mAb/N46都識(shí)別構(gòu)象型表位，但是它們