三疣梭子蟹微衛(wèi)星文庫的構(gòu)建及多態(tài)性位點(diǎn)篩選.pdf

1、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是一種重要的漁業(yè)資源，廣泛分布于我國沿海。從1981年起，三疣梭子蟹被列為我國海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一，以其經(jīng)濟(jì)效益可觀，食用營養(yǎng)價(jià)值高，生長繁殖快速等優(yōu)點(diǎn)，成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的主要品種之一。近年來，由于各方面原因，三疣梭子蟹的資源量急劇下降，對病害和環(huán)境脅迫的防御能力下降，自然種質(zhì)資源嚴(yán)重退化。為了恢復(fù)和提高親本蟹及蟹種的質(zhì)量，保持養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，同時(shí)為了避免野生種質(zhì)資源的衰竭，

2、實(shí)現(xiàn)該自然資源的可持續(xù)利用，對三疣梭子蟹進(jìn)行遺傳種質(zhì)資源研究已迫在眉睫。而開發(fā)一套合理有效的分子遺傳標(biāo)記，是開展該物種遺傳種質(zhì)資源保護(hù)研究的必要前提。
　　 本研究以舟山群島沿海的野生成體三疣梭子蟹為樣本，采用磁珠富集法構(gòu)建微衛(wèi)星DNA文庫。經(jīng)Sau3AI酶切后的200～1000bpDNA純化片段，與兩端已知序列的人工接頭連接，用含有生物素標(biāo)記的(CA)12，(GA)12和(TGC)8探針雜交，根據(jù)磁珠的鏈酶親和素與生物素特異結(jié)

3、合的特性，捕獲含微衛(wèi)星序列的單鏈DNA，以此為模板用人工接頭序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，TA克隆后，再篩選陽性克隆，構(gòu)建好富集文庫。測序其中的60個(gè)陽性克隆，得到42條微衛(wèi)星序列，其中完美型的占73.8％，非完美型的占21.4％，混合型的占4.8％，微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)主要集中在10～30次之間。
　　 利用Premier Primer5.0軟件，我們設(shè)計(jì)出31對三疣梭子蟹微衛(wèi)星引物，其中16對能夠穩(wěn)定擴(kuò)增出特異性目的片段。用這16對微

4、衛(wèi)星引物對舟山群島的38個(gè)野生三疣梭子蟹進(jìn)行PCR擴(kuò)增、8％的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染，最后成功檢測到11個(gè)具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)。
　　 用群體遺傳學(xué)軟件POPGENE32統(tǒng)計(jì)了這11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在舟山群島、廈門沿海兩個(gè)群體的遺傳多樣性，分析了兩群體的等位基因頻率、觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、基因觀測雜合度(Ho)、基因期望雜合度(He)和哈溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)。

5、結(jié)果顯示：11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在舟山群島、廈門沿海兩群體中的平均有效等位基因數(shù)分別為12.6(8.57～17.61)、12.9(7.17～17.89)，平均觀察雜合度分別為0.84(0.58～0.97)、0.82(0.68～0.93)，平均期望雜合度分別為0.92(0.88～0.94)、0.92(0.86～0.94)，平均多態(tài)信息含量分別為0.91(0.88～0.94)、0.92(0.85～0.94)。哈代-溫伯格平衡檢驗(yàn)結(jié)果表明，所有位點(diǎn)

6、均處于平衡狀態(tài)。這些結(jié)果顯示：三疣梭子蟹種群遺傳多樣性水平高，具有較高的選擇潛力。由于僅有兩個(gè)地點(diǎn)的采樣，兩種群之間沒有檢測出遺傳分化現(xiàn)象。在今后的實(shí)驗(yàn)中，需要增加采樣地點(diǎn)與樣本數(shù)，以期獲得種群遺傳分化更可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　 利用這套微衛(wèi)星位點(diǎn)，我們在紅星梭子蟹(P. sanguinolentus)和遠(yuǎn)海梭子蟹(P.pelagicus)兩個(gè)物種中進(jìn)行跨物種擴(kuò)增檢測。其中，3個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在遠(yuǎn)海梭子蟹中呈現(xiàn)多態(tài)性，2個(gè)位點(diǎn)在紅星梭