高致病性豬藍(lán)耳病病毒ORF7基因的可溶性表達(dá)及其免疫活性研究.pdf

1、2006年，我國(guó)爆發(fā)了高致病性豬藍(lán)耳病(High pathogenic porcine reproductive andrespiratory syndrome，HP-PRRS)。表現(xiàn)為不同年齡和體重的豬都能感染，以體溫升高、皮膚發(fā)紅和呼吸急促等為主要臨床癥狀。剖檢變化以彌漫性、出血性間質(zhì)性肺炎、淋巴結(jié)和各內(nèi)臟器官不同程度出血為突出特征。仔豬發(fā)病率達(dá)100％，死亡率可達(dá)50％以上，母豬流產(chǎn)率可達(dá)30％以上，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了空前的影響和

2、損失。
　　 PRRSV是單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)15Kb，含有8個(gè)開放閱讀框架(ORFs)。其中，ORF7編碼病毒的核衣殼蛋白(N)是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，免疫原性強(qiáng)且在型內(nèi)高度保守。豬感染PRRSV早期產(chǎn)生的抗體主要針對(duì)N蛋白，N蛋白在兩型毒株中具有共同的抗原位點(diǎn)，以N蛋白為抗原，可檢出病毒產(chǎn)生的特異性抗體，具有重要的診斷價(jià)值。
　　 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Genbank上公布的PRRSV美洲型毒株VR-2332株的基因序列

3、，設(shè)計(jì)了N基因的特異性引物P1/P2，利用RT-PCR擴(kuò)增出HP-PRRSV的ORF7基因片段，將擴(kuò)增的目的片段克隆入pET-28a、pGEX-4T-1載體并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，ORF7基因全長(zhǎng)372bp，包含完整的開放閱讀框架，編碼123個(gè)氨基酸。序列分析結(jié)果表明，ORF7基因核苷酸序列與16個(gè)美洲型株的同源性為94.1％～99.5％，而與歐洲型(LV)的同源性僅為65.6％。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹表明，所研究的高致病性豬藍(lán)耳病毒株仍然屬于美

4、洲型，與高致病性PRRSV毒株GD、JXA1、HUN4、LN、TJ、HEB1、HuB1、HuB2、HuN、JX1、SD-ZQ、SHH親緣關(guān)系較近。
　　 將己構(gòu)建得重組質(zhì)粒pET-ORF7轉(zhuǎn)化入宿主菌BL21(DE3)，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)SDS-PAGE分析表明，在17kDa處出現(xiàn)了目的條帶。確立了最適誘導(dǎo)表達(dá)條件為IPTG1mM、28℃作用4h。目的蛋白的分析表明表達(dá)產(chǎn)物主要以可溶性蛋白和包涵體兩種形式存在。經(jīng)Bands