杜氏利什曼原蟲(chóng)NH36基因的克隆與表達(dá).pdf

1、內(nèi)臟利什曼原蟲(chóng)病(visceral leishmaniasis，VL)是一種重要的人獸共患寄生蟲(chóng)病，其病原為杜氏利什曼原蟲(chóng)(Leishmania donovani)復(fù)合體。原蟲(chóng)都屬于嘌呤營(yíng)養(yǎng)缺陷型生物，只能依靠補(bǔ)救途徑合成嘌呤。核苷水解酶(Nucleoside hydrolases，NH)對(duì)原蟲(chóng)核苷酸補(bǔ)救途徑具有關(guān)鍵作用。研究表明，NH在利什曼原蟲(chóng)病診斷、疫苗免疫和作為哺乳動(dòng)物利什曼病治療藥物成分等方面具有很好的應(yīng)用前景，但目前我國(guó)對(duì)利

2、什曼原蟲(chóng)NH的研究尚屬空白。 重組蛋白疫苗以及核酸疫苗對(duì)于VL的免疫預(yù)防具有關(guān)鍵作用，L.donovani核苷水解酶36(L.d NH36)是其主要抗原復(fù)合體-巖藻糖-甘露糖配體復(fù)合體(fucose-mannose ligand，F(xiàn)ML)的主要免疫原性片段，因而，本研究建立了我國(guó)SC10H2株L.donovani的體外純培養(yǎng)，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增并克隆L.d NH36編碼基因，經(jīng)鑒定及序列分析，構(gòu)建其原核重組表達(dá)載體pET-

3、28a-L.d-NH36，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE和Westem blotting鑒定，證明了L.d NH36重組蛋白得到了成功表達(dá)；制備并純化了L.dNH36重組蛋白，腹腔免疫BALB/c鼠，采用流式細(xì)胞儀對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞免疫應(yīng)答進(jìn)行檢測(cè)；最后構(gòu)建了L.d NH36真核重組表達(dá)質(zhì)粒pVAXl-L.d-NH36，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后對(duì)其表達(dá)情況進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，獲得的NH36ORF為945 bp，編碼314個(gè)氨基酸

4、殘基，與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株MHOM/KE/1975/MutingaH9比對(duì)，基因序列以及氨基酸序列同源性分別為88.78％和89.49％；表達(dá)蛋白為36KD，經(jīng)lmmoI/L IPTG誘導(dǎo)6 h后表達(dá)量最高，薄層掃描顯示表達(dá)的蛋白占菌體蛋白總量的57％，該蛋白可被抗L.donovani的多克隆抗血清識(shí)別；L.dNH36重組蛋白免疫后試驗(yàn)組小鼠脾細(xì)胞流式細(xì)胞儀分析表明CD4<'+>T淋巴細(xì)胞進(jìn)行了的增殖，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一定水平的細(xì)胞免疫應(yīng)答；通過(guò)