轉(zhuǎn)attM基因彩色馬蹄蓮及AttM解酯酶抗體制備研究.pdf

1、彩色馬蹄蓮是天南星科（Araceae）中的一種單子葉觀賞植物，被公認(rèn)為21世紀(jì)“花卉之星”，市場(chǎng)前景廣闊。但由胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種（Pectobacteriumcarotovora subsp.carotovora，p.c.c）引起的細(xì)菌性軟腐?。╞acterial soft rot disease）造成田間和貯藏期彩色馬蹄蓮大量腐爛死亡，且目前沒(méi)有理想的防治對(duì)策，嚴(yán)重阻礙了彩色馬蹄蓮的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。
　　 近年來(lái)的研究發(fā)

2、現(xiàn)，細(xì)菌不同細(xì)胞間存在化學(xué)信號(hào)交流，當(dāng)群體信號(hào)分子達(dá)到一定密度時(shí)，菌體內(nèi)相關(guān)基因即啟動(dòng)表達(dá)，該現(xiàn)象被稱為群體感應(yīng)（quorum sensing，簡(jiǎn)稱QS）。在一些原核生物和真核生物中，人們已經(jīng)鑒定出一些群體感應(yīng)淬滅酶（quorum-quenching enzyme），這些群體感應(yīng)淬滅酶能夠降解病原菌產(chǎn)生的信號(hào)分子，使病原菌QS系統(tǒng)不能啟動(dòng)它所調(diào)控的基因，從而干擾QS系統(tǒng)，減輕和消除病原菌的致病性，防治病害的發(fā)生。胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜

3、亞種是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，其產(chǎn)生的常見(jiàn)信號(hào)分子是N-酰基-高絲氨酸內(nèi)酯類（N-Acyl-homoserine laclone，簡(jiǎn)稱AHL）物質(zhì)。迄今為止，已經(jīng)報(bào)道并研究的含群體感應(yīng)淬滅酶活性的菌種不下10種，不同來(lái)源的類AHL解酯酶（AHLase）在氨基酸序列上也有所不同。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，原核生物中的AHL可以劃歸為兩個(gè)簇，即AiiA簇和AttM簇。
　　 本研究根據(jù)已報(bào)道的attM基因序列設(shè)計(jì)引物，從土壤根癌農(nóng)桿菌（Agro

4、bacteriumtumefaciens）EHA105中PCR擴(kuò)增獲得attM基因，并使基因兩端攜帶合適的限制性酶切位點(diǎn)，將其克隆入植物表達(dá)載體pBI121，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pBI121-attM。重組質(zhì)粒通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，經(jīng)PCR，酶切和測(cè)序驗(yàn)證正確后，轉(zhuǎn)化土壤根癌農(nóng)桿菌EHA105。挑選陽(yáng)性克隆菌落，對(duì)其進(jìn)行菌落PCR、酶切和測(cè)序驗(yàn)證正確后，供轉(zhuǎn)化使用。
　　 由土壤根癌農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)，將含有nptⅡ

5、基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pBI121-attM轉(zhuǎn)化彩色馬蹄蓮的芽基盤(pán)切片，經(jīng)G-418篩選，最終從近萬(wàn)塊芽基盤(pán)切片中獲得了4株陽(yáng)性再生轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)gus染色和PCR檢測(cè)證明attM基因已整合到彩色馬蹄蓮基因組中。
　　 為進(jìn)一步研究和利用attM基因，為防控細(xì)菌性軟腐病奠定基礎(chǔ)，本研究根據(jù)已報(bào)道的attM基因序列設(shè)計(jì)引物，從土壤根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）中PCR擴(kuò)增獲得attM基因，構(gòu)建蛋白表達(dá)