家蠶病原白僵菌的遺傳多樣性及白僵蠶藥理作用的研究.pdf

1、白僵蠶是蠶蛾科家蠶（Bombyx mori）幼蟲(chóng)感染白僵菌（Beauveriabassiana（Bals.）Vuill）后致死的干燥菌蟲(chóng)體，作為我國(guó)名貴的傳統(tǒng)中藥資源，其利用已有數(shù)千年歷史。白僵蠶的藥用目前仍十分廣泛，513余種人用成藥中含有白僵蠶的有49余種，其中64余種兒科成藥中有29余種用白僵蠶。白僵蠶味咸，性微溫，具有解毒、降膽固醇、抗驚厥、鎮(zhèn)靜、祛痰等作用，臨床上用于治療小兒驚癇、痙攣夜啼、中風(fēng)、喉痹、野火丹毒、金瘡、半身不遂

2、等癥，對(duì)腮腺炎、癲癇、腦炎后遺癥、部分動(dòng)脈硬化、癌癥、糖尿病等也均有一定療效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，白僵蠶的藥理作用與白僵蠶的活性成分密切相關(guān)。我國(guó)是世界上最大的養(yǎng)蠶國(guó)，蠶區(qū)地域廣闊，地理環(huán)境差異很大，這會(huì)形成許多不同的白僵菌菌株。不同白僵菌菌株在蠶體內(nèi)繁殖代謝產(chǎn)生的活性成分會(huì)存在差異，這進(jìn)而影響白僵蠶的藥效。查明白僵菌菌株間的系統(tǒng)發(fā)育差異以及白僵蠶的藥效機(jī)理與活性成分，可為尋找優(yōu)質(zhì)白僵蠶中藥資源，提高白僵蠶的藥用范圍與藥用水平等，提供科

3、學(xué)依據(jù)。本研究利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）技術(shù)和核糖體（rDNA）內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列分析，研究了家蠶病原白僵菌的系統(tǒng)發(fā)育和菌株間親緣關(guān)系，并以抗氧化性為中心，采用測(cè)定、分離、純化等方法，研究了白僵蠶的抗氧化、抗癌、降血糖等藥理作用，并對(duì)其中的活性物質(zhì)進(jìn)行了分析。主要研究結(jié)果如下：
　　 1、篩選出13個(gè)隨機(jī)引物，對(duì)從我國(guó)不同蠶區(qū)分離的21株白僵菌菌株進(jìn)行RAPD分析。結(jié)果得到的擴(kuò)增圖譜中，共有92個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其

4、中來(lái)自遼寧沈陽(yáng)、山西夏縣和吉林永吉蠶區(qū)的白僵菌菌株（Bbl3、Bbl5和Bb20）的帶譜相近，但與其他18株白僵菌菌株間有明顯差異。結(jié)果表明，不同地理來(lái)源的家蠶病原白僵菌，盡管大多數(shù)菌株間的遺傳信息還基本一致，但每個(gè)菌株間表現(xiàn)出一定的多態(tài)性，出現(xiàn)了一定的遺傳分化?；诎捉┚觊g的相似性系數(shù)分析和應(yīng)用非加權(quán)算術(shù)平均數(shù)聚類法（UnweightedPair-Group Method using Arithmetic Average,UPGM

5、A），構(gòu)建了家蠶病原白僵菌的UPGMA聚類樹(shù)狀圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，21株家蠶病原白僵菌菌株間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，與其采集的地理分布呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，不同地理來(lái)源的家蠶病原白僵菌雖然寄主相同、表型相似，但已呈現(xiàn)一定的DNA多態(tài)性，RAPD可以很好地檢測(cè)出其遺傳物質(zhì)的變化。
　　 對(duì)21株家蠶病原白僵菌菌株的ITS區(qū)（ITSl-5.8S rDNA-ITS2）進(jìn)行序列測(cè)定，所有序列經(jīng)排列并用Mega3.0軟件進(jìn)行分析，得到了最簡(jiǎn)約的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

6、結(jié)果采集自廣西南寧、貴州遵義和云南蒙自的白僵菌菌株（Bb03、Bb06和Bb07）的ITS區(qū)序列，與其他白僵菌菌株間的差異顯著，在NCBI GenBank中進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與球孢蟲(chóng)草（Cordyceps bassiana）同源性為100％（accession number:AB027382）；采集自吉林永吉和山東煙臺(tái)的白僵菌菌株（Bb20和Bb21）有較多位點(diǎn)的突變，而其他白僵菌菌株ITS區(qū)序列完全一致或僅有幾個(gè)位點(diǎn)的堿基對(duì)缺失或變

7、異。結(jié)果表明，家蠶病原白僵菌的ITS序列在種內(nèi)水平相對(duì)保守，菌株間差異不顯著。對(duì)家蠶病白僵菌菌株間的遺傳變異及親緣關(guān)系的分析，ITS序列不如RAPD敏感，但由于其種內(nèi)的保守性，使其對(duì)相似種間的分類鑒定更加可靠。
　　 2、以氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇和蒸餾水為溶劑，依次抽提白僵蠶，測(cè)定各提取物中酚類物質(zhì)的含量，結(jié)果白僵蠶的甲醇提取物中酚類物質(zhì)含量最高，為10.75±0.35mgGAE/g，其次為乙酸乙酯提取物和丙酮提取物，酚類物

8、質(zhì)含量分別為4.95±0.11mgGAE/g和4.55±0.03mgGAE/g，氯仿提取物中酚類物質(zhì)含量最低，為2.78±0.39 mg GAE/g。測(cè)定白僵蠶各提取物的DPPH自由基清除活性、還原能力、鐵離子絡(luò)合能力以及亞油酸系統(tǒng)抑制過(guò)氧化反應(yīng)能力，結(jié)果除氯仿提取物外，其余各提取物均表現(xiàn)出良好的抗氧化活性，并與濃度呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系，其中甲醇提取物的抗氧化能力最強(qiáng)，其清除DPPH自由基、絡(luò)合亞鐵離子、抑制過(guò)氧化反應(yīng)的半抑制濃度（IC5

9、0）分別為0.20±0.00mg/mL、0.39±0.01mg/mL、0.71±0.03mg/mL。結(jié)果表明，白僵蠶中的活性物質(zhì)可以有效地清除自由基，參與氧化還原反應(yīng)，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，顯示出明顯的抗氧化作用，其抗氧化活性可能與酚類物質(zhì)含量相關(guān)。
　　 3、選取人肝癌細(xì)胞株Hep G2、人宮頸癌細(xì)胞株HeLa、人髓性白血病細(xì)胞株HL-60、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)，測(cè)定白僵蠶的氯仿、乙酸乙酯、丙酮

10、、甲醇和蒸餾水提取物對(duì)這4株癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。結(jié)果白僵蠶各提取物均能體外抑制Hep G2、Hela、MCF-7和HL-60細(xì)胞的生長(zhǎng)，其中氯仿提取物的抑制作用最強(qiáng)，其IC50值依次為0.34mg/mL、0.49 mg/mL、0.77 mg/mL和1.16mg/mL，其次為乙酸乙酯提取物、甲醇提取物和蒸餾水提取物，丙酮提取物的抑制作用最弱，其IC50值均＞2.5mg/mL。結(jié)果表明，白僵蠶具有一定的抗腫瘤活性，作為天然抗腫瘤藥物篩選的

11、資源，具有一定的價(jià)值。
　　 4、采用正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)白僵蠶多糖的測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化，確立了白僵蠶粉過(guò)160目、超聲波提取50min、在100℃水浴中提取60min、重復(fù)抽提2次，為白僵蠶多糖的最佳提取方案。建立了白僵蠶多糖含量測(cè)定的分光光度法，該方法的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、加樣回收率等均符合測(cè)定要求。白僵蠶富含多糖，其含量隨家蠶感染病原白僵菌后天數(shù)的增加而顯著提高，從感染第1天的2.07±0.24mg/g提高到感染第7天的11.84±0.

12、44 mg/g，提高了約6倍。
　　 5、以清除DPPH自由基、過(guò)氧化氫、羥自由基和超氧陰離子自由基的活性為指標(biāo)，測(cè)定了白僵蠶多糖的體外抗氧化活性。結(jié)果白僵蠶多糖對(duì)DPPH自由基、過(guò)氧化氫、羥自由基和超氧陰離子自由基具有一定的清除作用，其IC50值分別為0.15mg/mL、>1mg/mL、0.98 mg/mL和0.85 mg/mL，并且其清除作用與其濃度呈一定的量效關(guān)系。結(jié)果表明，白僵蠶多糖具有一定的體外抗氧化活性。
　　

13、 6、給小鼠灌胃白僵蠶多糖，通過(guò)小鼠血清和肝臟中超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛（MDA）含量和谷胱甘肽（GSH）含量的測(cè)定，研究白僵蠶多糖的體內(nèi)抗氧化活性。結(jié)果白僵蠶多糖能提高小鼠血清及肝臟中的SOD活性、GSH含量，并降低小鼠血清及肝臟中的MDA含量。結(jié)果表明，白僵蠶多糖可明顯增強(qiáng)小鼠內(nèi)源性氧自由基清除系統(tǒng)的功能，減少由于自由基作用于膜脂質(zhì)化合物而生成脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA，調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)自由基水平及氧化還原信號(hào)的傳遞，表現(xiàn)出生物抗氧

14、化活性。
　　 7、以腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）制備糖尿病小鼠模型，灌胃給藥，通過(guò)小鼠體重、攝食量、飲水量、血糖值、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、胰島素含量等指標(biāo)測(cè)定，研究白僵蠶多糖的降血糖功能。結(jié)果白僵蠶多糖能明顯改善糖尿病模型小鼠的消瘦癥狀，調(diào)節(jié)糖尿病小鼠的飲食水平，降低血糖濃度，降低血清總膽固醇水平和提高高密度脂蛋白水平，但對(duì)血清甘油三酯水平和胰島素含量無(wú)明顯的影響。結(jié)果提示，白僵蠶多糖對(duì)糖

15、尿病具有一定的治療作用，其治療機(jī)理可能是通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體糖代謝、促進(jìn)肝糖原合成、減少肝糖原分解來(lái)實(shí)現(xiàn)的，而不是通過(guò)刺激胰島β細(xì)胞分泌胰島素來(lái)作用的。
　　 8、對(duì)白僵蠶常規(guī)成分、微量元素、氨基酸及脂肪酸的含量進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)白僵蠶的水分、灰分、粗脂肪和粗蛋白的含量分別為8.62％、8.40％、4.9％和69.3％；白僵蠶富含微量元素，所測(cè)定的12種微量元素中，磷、鈣、鎂、鋅、錳的含量較高，分別為4911.7mg/kg、4610.8

16、mg/kg、3346.1mg/kg、121.4mg/kg、30.4mg/kg，硒的含量為0.24 mg/kg，比富硒抗癌中藥黃芪（含硒0.08 mg/kg）的高3倍；白僵蠶中含有天門(mén)冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸等17種氨基酸，總含量為32.87％，其中甘氨酸含量最高（4.89％），必需氨基酸占總氨基酸的比率為27.60％；白僵蠶脂肪酸中不飽和脂肪酸的含量高達(dá)78.86％，其中亞油酸、亞麻酸等必須脂肪酸的含量占77.63％，尤其是n-3系列的多