葡萄卷葉伴隨病毒2基因分子變異及基因重組分析.pdf

1、葡萄卷葉病(Grapevineleafrolldisease，GLD)是世界上分布最廣的葡萄病毒病，凡是葡萄栽培地區(qū)均有發(fā)生卷葉病。卷葉病的發(fā)生嚴(yán)重影響葡萄的品質(zhì)和產(chǎn)量，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。到目前為止，相繼報(bào)道了11種可引起GLD的病毒，稱為葡萄卷葉伴隨病毒GLRaVs(Grapevineleafrollassociatedvirus)，即GLRaV-1～9，除此之外，Maliogka又報(bào)道了兩種不同于以上九種的分離物GLRaV-Pr,G

2、LRaV-De。這11種病毒均屬于長(zhǎng)線性病毒科（Closteroviridae），其中只有GLRaV-2為長(zhǎng)線病毒屬（Closterovirus）成員，除GLRaV-7尚未歸屬外，其它GLRaVs均歸為葡萄病毒屬(Ampelovirus)。
　　 本研究采用RT-PCR技術(shù)對(duì)采自鄭州國(guó)家葡萄種質(zhì)資源圃、湖北省果茶研究所及華中農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄園的表現(xiàn)卷葉病癥狀的70多份葡萄樣品進(jìn)行了RT-PCR檢測(cè)，共檢出11種樣品帶有葡萄卷葉病毒-

3、2，并將所有檢出樣品扦插保存于溫室，具體研究結(jié)果如下：
　　 1.從葡萄韌皮部組織中提取病毒雙鏈RNA后，根據(jù)Marais在GenBank上登錄的序列設(shè)計(jì)引物HSP-L1/HSP-R2，擴(kuò)增獲得GLRaV-2的HSP70部分基因片段(432bp),CP-L1/CP-R2引物擴(kuò)增獲得其CP基因全長(zhǎng)(597bp)，并對(duì)其進(jìn)行克隆，每個(gè)樣品選取3個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序。序列分析結(jié)果顯示，來自每個(gè)樣品內(nèi)的3個(gè)克隆片段間序列高度相似，其分離物內(nèi)H

4、SP70h遺傳距離為0.000-0.008，CP遺傳距離為0.002-0.010，因此來自11個(gè)樣品的GLRaV-2可分別視為單個(gè)分離物，無(wú)復(fù)合侵染情況。
　　 2.11個(gè)GLRaV-2分離物的CP及HSP70基因核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列經(jīng)DNAMAN比對(duì)，結(jié)果表明來自這些葡萄樣品的該病毒CP基因比較保守，其核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列同源性分別為97.3％-100％和98.5％-100％。但HSP70存在較大的變異，分離物

5、間的HSP70核苷酸和氨基酸同源性分別為74.5％-100％和80.6％-100％，其中來自tr及hn的兩個(gè)樣品的GLRaV-2與其它9個(gè)分離物間存在極其明顯的分子差異，這兩個(gè)分離物間的HSP70核苷酸和氨基酸同源性分別為99.3％和99.5％，而與其它各分離物間的核苷酸和氨基酸同源性分別僅為74.5％-75.8％和79.9％-82.6％。
　　 3.將獲得的序列與Genbank己登錄序列進(jìn)行比較分析，最終的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，對(duì)于

6、CP基因分析，11種分離物與前期中國(guó)報(bào)道的兩個(gè)分離物均相聚在以GLRaV-2-PN為代表的一個(gè)分支中。而對(duì)于HSP70所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，11種分離物被分在GLRaV-2-PN及GLRaV-2-RG兩個(gè)組中，tr及hn兩個(gè)樣品屬于GLRaV-2-RG一組。
　　 4.根據(jù)HSP70構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹特點(diǎn)，選取各分支的來自藤稔、紫地球和大阪的代表性分離物，采用引物GLRaV-2-4/GLRaV-2-5對(duì)其ORF8與3'-NC