不同被毛密度獺兔皮膚組織的差異表達(dá)基因篩選和CCNA2基因的多態(tài)性檢測(cè)及其與被毛密度的相關(guān)性研究.pdf

1、獺兔(力克斯兔)是一種典型的裘皮用兔,評(píng)價(jià)獺兔毛皮品質(zhì)的主要指標(biāo)有被毛密度、被毛長度、粗毛率、絨毛細(xì)度和皮張面積,而目前我國獺兔毛皮品質(zhì)方面存在的問題主要集中在被毛密度及皮張面積上。如何提高我國獺兔的毛皮品質(zhì)以提高市場(chǎng)競爭力,是目前亟待解決的問題。
　　 本研究以獺兔為研究對(duì)象,利用基因芯片技術(shù),對(duì)不同被毛密度獺兔的皮膚組織中差異表達(dá)的基因進(jìn)行篩選,并采用實(shí)時(shí)定量PCR方法對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證；采用RT-PCR方法克隆獺兔的CCN

2、A2基因序列,通過測(cè)序結(jié)合PCR-RFLP技術(shù)對(duì)獺兔CCNA2基因進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性檢測(cè),并探討其與獺兔毛皮品質(zhì)特別是被毛密度的關(guān)系,旨在為獺兔分子標(biāo)記輔助選擇提供有效的遺傳標(biāo)記。
　　 研究結(jié)果如下:
　　 (1)利用家兔全基因表達(dá)譜芯片篩選出了2657個(gè)在不同被毛密度獺兔皮膚組織間差異表達(dá)的基因,其中包含1106個(gè)已知功能的基因,表達(dá)上調(diào)的基因687個(gè),表達(dá)下調(diào)的基因419個(gè)。GO分類顯示:大部分差異表達(dá)的基因位于細(xì)

3、胞膜、細(xì)胞融入膜或細(xì)胞融入質(zhì)膜；屬于核苷酸、蛋白質(zhì)、DNA及離子結(jié)合類分子；主要涉及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),發(fā)育以及細(xì)胞增殖、分化、凋亡等。KEGG信號(hào)通路分析顯示:在表達(dá)上調(diào)的基因中95個(gè)通路功能狀態(tài)發(fā)生的改變有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),涉及細(xì)胞粘附分子、TGFβ、MAPK、Wnt信號(hào)通路等；在表達(dá)下調(diào)的基因中87個(gè)通路功能狀態(tài)發(fā)生的改變有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),涉及細(xì)胞周期、氧化磷酸化、p53信號(hào)通路等。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果與基因芯片結(jié)果

4、基本吻合,證實(shí)基因芯片結(jié)果可靠。
　　 (2)通過基因芯片試驗(yàn),很多與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等有關(guān)的基因被篩選出來,如:MMP2、TGFβ1、TGFβ2、IGF-1B、BMP2、ActRⅡ B、CDK2、CCNA2等,這些基因的差異表達(dá),可能參與皮膚毛囊的形成或分化過程,最終導(dǎo)致獺兔被毛密度的差異。結(jié)合多方面的分析結(jié)果,最終選定細(xì)胞周期素A2(CCNA2)基因作為后續(xù)試驗(yàn)的候選基因。
　　 (3)通過RT-P

5、CR方法克隆出了獺兔的CCNA2基因序列。通過測(cè)序結(jié)合PCR-RFLP技術(shù)檢測(cè)出了CCNA2基因的兩個(gè)SNPs位點(diǎn):129G>A位點(diǎn)引起了限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)ScaⅠ的變化,是丙氨酸的同義突變；1140G>C位點(diǎn)引起了限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)AflⅡ的變化,是從賴氨酸到天冬酰胺的錯(cuò)義突變。
　　 (4)在試驗(yàn)兔群中,CCNA2基因的129G>A位點(diǎn)的G等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)基因,GG型的基因型頻率高于AA型的基因型頻率；1140G>C位點(diǎn)的

6、G等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)基因,GG型的基因型頻率高于CC型的基因型頻率。這兩個(gè)位點(diǎn)均處于中度多態(tài)(0.250.05)。
　　 (5)對(duì)獺兔的CCNA2基因多態(tài)性和毛皮品質(zhì)相關(guān)性分析表明,129G>A位點(diǎn)的GG基因型的背中部被毛密度顯著高于GA型和AA型；1140G>C位點(diǎn)的GG基因型的背中部被毛密度顯著高于GC型和CC型；CCNA2基因129G>A位點(diǎn)和1